ショウ ジョウバエ 胚におけるRho1を介したアクトミオシン収縮性の光遺伝学的阻害と上皮圧の測定

要約

アクトミオシンの収縮性は、細胞および組織の形態形成において重要な役割を果たす。しかし、 生体内で アクトミオシンの収縮性を鋭く操作することは困難である。このプロトコルは、 ショウジョウバエ 胚におけるRho1を介したアクトミオシン収縮性を迅速に阻害する光遺伝学的システムを記述し、 in vivoでのアクトミオシンの不活性化後の上皮張力の即時喪失を明らかにしています。

要約

アクチンおよび非筋肉ミオシンIIによって生成される収縮力(「アクトミオシン収縮性」)は、細胞分裂、細胞遊走、上皮折り畳み、分岐形態形成など、複数の長さスケールでの細胞および組織の形態学的変化にとって重要です。形態形成におけるアクトミオシン収縮性の役割を深く理解するには、従来の遺伝学的または薬理学的アプローチでは達成が困難なアクトミオシンの迅速な不活性化を可能にするアプローチが必要です。提示されたプロトコルは、CRY2-CIBNベースの光遺伝学的二量体化システムであるOpto-Rho1DNを使用して、ショ ウジョウバエ 胚のアクトミオシン収縮性を阻害し、正確な時間的および空間的制御を行うことを実証しています。このシステムでは、CRY2はドミナントネガティブ型のRho1(Rho1DN)に融合し、CIBNは原形質膜に固定されています。CRY2とCIBNの青色光を介した二量体化は、細胞質から原形質膜へのRho1DNの急速な移行をもたらし、内因性Rho1を阻害することによってアクトミオシンを不活性化します。さらに、この記事では、ショウ ジョウバエ 腹側溝形成中の上皮張力の生成におけるアクトミオシンの役割を調査するために、Opto-Rho1DNを介したアクトミオシンの不活性化とレーザーアブレーションを組み合わせるための詳細なプロトコルを紹介します。このプロトコルは、ショ ウジョウバエ 胚におけるアクトミオシン収縮性を含む他の多くの形態学的プロセスに最小限の修飾で適用することができる。全体として、この光遺伝学的ツールは、動的組織リモデリング中の組織力学の制御におけるアクトミオシン収縮性の機能を分析するための強力なアプローチです。

概要

アクトミオシンの収縮性は、非筋ミオシンII(以下、ミオシン)がF-アクチンネットワークに及ぼす収縮力であり、細胞の形状を変化させ、組織レベルの形態形成を促進する上で最も重要な力の1つです^1,2。例えば、上皮細胞の頂端ドメインにおけるアクトミオシン収縮性の活性化は、頂端狭窄をもたらし、これは、上皮折り畳み、細胞押し出し、層間剥離、および創傷治癒を含む様々な形態形成プロセスを促進する3,4,5,6,7 .ミオシンの活性化は、その調節軽鎖のリン酸化を必要とする。この修飾は、ミオシン分子の阻害的立体配座を緩和し、それらが両端に複数のヘッドドメインを有する双極性ミオシンフィラメントバンドルを形成することを可能にする。バイポーラミオシンフィラメントは、アクチンフィラメントの反平行運動を駆動し、収縮力の生成をもたらします^1,8,9。^<....

プロトコル

1.遺伝子交配の設定と採卵カップの準備

1. 光遺伝学系統UASp-CIBNpm(I)から雌のハエ(処女)を選択する。実体顕微鏡下のCO₂ パッド上にUASp-CRY2-Rho1DN-mCherry(III)を設置し、母方のGAL4ドライバーライン67Sqh-mCherryからのオスのハエとの交配を設置した。15 E-カドヘリン-GFP。
   注:67と15は、それぞれ2番目(II)と3番目(III)の染色体に挿入された母体チューブリン-GAL4を表します⁵²。このプロトコルで使用されるGAL4系統は、mCherryタグ付きミオシン調節軽鎖Sqh(スパゲッティスカッシュ)³⁷ およびGFPタグ付きE-カドヘリン⁵³も発現します。光遺伝学的系統からのハエは、依然としてFM7およびTM6バランサー染色体を含み得る。母体のGAL4ドライバー系統からのハエは、依然としてCyOおよびTM3バランサー染色体を含む可能性があります。
2. ~10日後、次の遺伝子型を持つF1メスのハエを選択します:UASp-CIBNpm/+;67平方mチェリー/+;15 E-カドヘリン-GFP/UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry.オスのハエと一緒に卵収集カップを設置します。
   1. 正しい遺伝子型のメスのハエに、株の....

ディスカッション

このプロトコルは、アクトミオシン収縮性の不活性化直後の組織張力の変化をプローブするためのオプトジェネティクスとレーザーアブレーションの併用について説明しました。ここで説明する光遺伝学的ツールは、Rho1(Rho1DN)のドミナントネガティブ型を利用して、内因性Rho1およびRho1依存性アクトミオシン収縮性を急激に阻害します。ショウジョウバエ腹側溝形成の文脈におけるOpto-.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C	Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid	Falcon	351007	Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope	Online	NA	Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite)	VWR	10028-048	Used for embryo dechorination
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114	Used for cross set-up
ddH2O	NA	NA	Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers	VWR	102091-654	Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2)	VWR	22940-834	Used for sample preparation
FluoView (Software)	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27	Sigma Aldrich	H8773-100ML	Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI	NIH	NA	Used for image analysis
MATLAB	MathWorks	NA	Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope	Nikon	NA	Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light.	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer)	VWR	30621-392	Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield)	Bolioptics	FM14036151	Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights	Amazon	NA	Used to avoid unwanted light stimulation