Optogenetische Hemmung der Rho1-vermittelten Actomyosin-Kontraktilität gekoppelt mit Messung der Epithelspannung in Drosophila-Embryonen

Zusammenfassung

Die Kontraktilität von Actomyosin spielt eine wichtige Rolle bei der Zell- und Gewebemorphogenese. Es ist jedoch schwierig, die Actomyosin-Kontraktilität in vivo akut zu manipulieren. Dieses Protokoll beschreibt ein optogenetisches System, das die Rho1-vermittelte Actomyosin-Kontraktilität in Drosophila-Embryonen schnell hemmt und den sofortigen Verlust der Epithelspannung nach der Inaktivierung von Actomyosin in vivo aufdeckt.

Zusammenfassung

Kontraktile Kräfte, die durch Aktin und Nicht-Muskelmyosin II erzeugt werden ("Actomyosin-Kontraktilität"), sind entscheidend für morphologische Veränderungen von Zellen und Geweben auf mehreren Längenskalen, wie z. B. Zellteilung, Zellmigration, Epithelfaltung und verzweigte Morphogenese. Ein tiefgreifendes Verständnis der Rolle der Aktomyosin-Kontraktilität in der Morphogenese erfordert Ansätze, die eine schnelle Inaktivierung von Actomyosin ermöglichen, die mit herkömmlichen genetischen oder pharmakologischen Ansätzen nur schwer zu erreichen ist. Das vorgestellte Protokoll demonstriert die Verwendung eines CRY2-CIBN-basierten optogenetischen Dimerisierungssystems, Opto-Rho1DN, zur Hemmung der Aktomyosin-Kontraktilität in Drosophila-Embryonen mit präzisen zeitlichen und räumlichen Kontrollen. In diesem System ist CRY2 mit der dominanten negativen Form von Rho1 (Rho1DN) fusioniert, während CIBN an der Plasmamembran verankert ist. Die Blaulicht-vermittelte Dimerisierung von CRY2 und CIBN führt zu einer schnellen Translokation von Rho1DN aus dem Zytoplasma in die Plasmamembran, wo es Actomyosin durch Hemmung von endogenem Rho1 inaktiviert. Darüber hinaus wird in diesem Artikel ein detailliertes Protokoll für die Kopplung der Opto-Rho1DN-vermittelten Inaktivierung von Aktomyosin mit der Laserablation vorgestellt, um die Rolle von Actomyosin bei der Erzeugung von Epithelspannung während der ventralen Furchenbildung von Drosophila zu untersuchen. Dieses Protokoll kann auf viele andere morphologische Prozesse angewendet werden, die die Aktomyosin-Kontraktilität in Drosophila-Embryonen mit minimalen Modifikationen beinhalten. Insgesamt ist dieses optogenetische Werkzeug ein leistungsfähiger Ansatz, um die Funktion der Actomyosin-Kontraktilität bei der Kontrolle der Gewebemechanik während des dynamischen Gewebeumbaus zu untersuchen.

Einleitung

Die Actomyosin-Kontraktilität, die kontraktile Kraft, die von Nicht-Muskel-Myosin II (im Folgenden "Myosin") auf das F-Aktin-Netzwerk ausgeübt wird, ist eine der wichtigsten Kräfte bei der Veränderung der Zellform und der Steuerung der Morphogenese auf Gewebeebene ^1,2. Zum Beispiel führt die Aktivierung der Actomyosin-Kontraktilität an der apikalen Domäne der Epithelzellen zu einer apikalen Verengung, die eine Vielzahl morphogenetischer Prozesse erleichtert, darunter Epithelfaltung, Zellextrusion, Delamination und Wundheilung 3,4,5,6,7

Protokoll

1. Aufstellen der genetischen Kreuzung und Vorbereiten des Eizellentnahmebechers

1. Ausgewählte weibliche Fliegen (jungfräulich) aus der optogenetischen Linie UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) auf einem CO₂ -Pad unter einem Stereomikroskop und eine Kreuzung mit männlichen Fliegen aus der mütterlichen GAL4-Treiberlinie 67 Sqh-mCherry; 15 E-Cadherin-GFP.
   ANMERKUNG: Die 67 und 15 stehen für maternales Tubulin-GAL4, das in das zweite (II) bzw. dritte (III) Chromosom eingefügt ist,⁵². Die in diesem Protokoll verwendete GAL4-Linie exprimiert auch die mCherry-markierte regulatorische Myosin-Leichtket....

Diskussion

Dieses Protokoll beschrieb den kombinierten Einsatz von Optogenetik und Laserablation, um Veränderungen der Gewebespannung unmittelbar nach der Inaktivierung der Aktomyosin-Kontraktilität zu untersuchen. Das hier beschriebene optogenetische Werkzeug nutzt die dominante negative Form von Rho1 (Rho1DN), um die endogene Rho1- und Rho1-abhängige Actomyosin-Kontraktilität akut zu hemmen. Die vorherige Charakterisierung von Opto-Rho1DN im Zusammenhang mit der ventralen Furchenbildung von Drosophila zeigte, dass da.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C	Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid	Falcon	351007	Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope	Online	NA	Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite)	VWR	10028-048	Used for embryo dechorination
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114	Used for cross set-up
ddH2O	NA	NA	Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers	VWR	102091-654	Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2)	VWR	22940-834	Used for sample preparation
FluoView (Software)	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27	Sigma Aldrich	H8773-100ML	Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI	NIH	NA	Used for image analysis
MATLAB	MathWorks	NA	Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope	Nikon	NA	Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light.	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer)	VWR	30621-392	Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield)	Bolioptics	FM14036151	Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights	Amazon	NA	Used to avoid unwanted light stimulation