Оптогенетическое ингибирование Rho1-опосредованной сократимости актомиозина в сочетании с измерением эпителиального натяжения у эмбрионов дрозофилы

Резюме

Сократительная способность актомиозина играет важную роль в морфогенезе клеток и тканей. Тем не менее, сложно оперативно манипулировать сократительной способностью актомиозина in vivo . Этот протокол описывает оптогенетическую систему, которая быстро ингибирует Rho1-опосредованную сократительную способность актомиозина у эмбрионов дрозофилы , выявляя немедленную потерю эпителиального напряжения после инактивации актомиозина in vivo.

Аннотация

Сократительные силы, генерируемые актином и немышечным миозином II («сократительная способность актомиозина»), имеют решающее значение для морфологических изменений клеток и тканей в различных масштабах длины, таких как деление клеток, миграция клеток, сворачивание эпителия и морфогенез ветвления. Глубокое понимание роли сократительной способности актомиозина в морфогенезе требует подходов, позволяющих осуществлять быструю инактивацию актомиозина, чего трудно достичь с помощью традиционных генетических или фармакологических подходов. Представленный протокол демонстрирует использование системы оптогенетической димеризации Opto-Rho1DN на основе CRY2-CIBN для ингибирования сократительной способности актомиозина у эмбрионов дрозофилы с точным временным и пространственным контролем. В этой системе CRY2 сливается с доминирующей отрицательной формой Rho1 (Rho1DN), тогда как CIBN закрепляется на плазматической мембране. Опосредованная синим светом димеризация CRY2 и CIBN приводит к быстрой транслокации Rho1DN из цитоплазмы в плазматическую мембрану, где он инактивирует актомиозин путем ингибирования эндогенного Rho1. Кроме того, в данной статье представлен подробный протокол сопряжения Opto-Rho1DN-опосредованной инактивации актомиозина с лазерной абляцией для изучения роли актомиозина в генерации эпителиального натяжения при формировании вентральной борозды дрозофилы . Этот протокол может быть применен ко многим другим морфологическим процессам, включающим сократительную способность актомиозина у эмбрионов дрозофилы с минимальными модификациями. В целом, этот оптогенетический инструмент является мощным подходом к анализу функции сократительной способности актомиозина в контроле механики тканей во время динамического ремоделирования тканей.

Введение

Сократительная способность актомиозина, сократительная сила, оказываемая немышечным миозином II (далее «миозин») на F-актиновую сеть, является одной из наиболее важных сил в изменении формы клеток и управлении морфогенезом на тканевом уровне ^1,2. Например, активация сократительной способности актомиозина в апикальном домене эпителиальных клеток приводит к апикальному сужению, что способствует различным морфогенетическим процессам, включая сворачивание эпителия, экструзию клеток, расслоение и заживление ран 3,4,5,6,7 <....

протокол

1. Установка генетического скрещивания и подготовка чашки для сбора яйцеклеток

1. Селекция самок мух (девственных) из оптогенетической линии UASp-CIBNpm (I); UASp-CRY2-Rho1DN-mCherry (III) на подушечке CO₂ под стереомикроскопом и установили скрещивание с самцами мух из материнской линии драйвера GAL4 67 Sqh-mCherry; 15 Е-кадгерин-GFP.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 67 и 15 означают материнский тубулин-GAL4, вставленный во вторую (II) и третью (III) хромосомы, соответственно⁵². Линия GAL4, используемая в этом протоколе, также экспрессирует регуляторную легкую цепь миозина Sqh (Spaghetti squash)³⁷ и мече....

Результаты

У нестимулированных эмбрионов, подвергшихся апикальной констрикции, Sqh-mCherry обогащался в медиоапикальной области вентральных мезодермальных клеток, тогда как CRY2-Rho1DN-mCherry был цитозольным (рис. 1A). Лазерная абляция в пределах констрикционного домена приводила к быстрому ?.......

Обсуждение

Этот протокол описывал комбинированное использование оптогенетики и лазерной абляции для зондирования изменений натяжения тканей сразу после инактивации сократимости актомиозина. Оптогенетический инструмент, описанный здесь, использует преимущества доминантной негативной формы R.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass-bottom dish	MatTek	P35G-1.5-10-C	Used for sample preparation
60 mm × 15 mm Petri dish with lid	Falcon	351007	Used for sample preparation
Black cloth for covering the microscope	Online	NA	Used to avoid unwanted light stimulation
Clorox Ultra Germicadal Bleach (8.25% sodium hypochlorite)	VWR	10028-048	Used for embryo dechorination
CO2 pad	Genesee Scientific	59-114	Used for cross set-up
ddH2O	NA	NA	Used for sample preparation
Dumont Style 5 tweezers	VWR	102091-654	Used for sample preparation
Eyelash tool (made from pure red sable round brush #2)	VWR	22940-834	Used for sample preparation
FluoView (Software)	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
Halocarbon oil 27	Sigma Aldrich	H8773-100ML	Used for embryo stage visualization
ImageJ/FIJI	NIH	NA	Used for image analysis
MATLAB	MathWorks	NA	Used for image analysis
Nikon SMZ-745 stereoscope	Nikon	NA	Used for sample preparation
Olympus FVMPE-RS multiphoton microscope with InSight DS Dual-line Ultrafast Lasers for simultaneous dual-wavelength multiphoton imaging, , a 25x/NA1.05 water immersion objective (XLPLN25XWMP2), and an IR/VIS stimulation unit for photo-activation/stimulation. This system is also equipped with a TRITC filter (39005-BX3; AT-TRICT-REDSHFT 540/25x, 565BS, 620/60M), and a fluorescence illumination unit that emits white light.	Olympus	NA	Used for image acquisition and optogenetic stimulation
SP Bel-Art 100-place polypropylene freezer storage box (Black, light-proof box for sample transfer)	VWR	30621-392	Used to avoid unwanted light stimulation
UV Filter Shield for FM1403 Fluores (Orange-red plastic shield)	Bolioptics	FM14036151	Used to avoid unwanted light stimulation
VITCHELO V800 Headlamp with White and Red LED Lights	Amazon	NA	Used to avoid unwanted light stimulation