الكشف عن الميتوفاجي في Caenorhabditis elegans وخلايا الثدييات باستخدام الأصباغ الخاصة بالعضيات

Summary

يتطلب استكشاف الميتوفاجي من خلال المجهر الإلكتروني وأجهزة الاستشعار الجينية والتألق المناعي معدات مكلفة وموظفين مهرة واستثمارا كبيرا للوقت. هنا ، نوضح فعالية مجموعة صبغة مضان تجارية في تحديد عملية الميتوفاجي في كل من Caenorhabditis elegans وخط خلايا سرطان الكبد.

Abstract

الميتوكوندريا ضرورية لمختلف الوظائف البيولوجية ، بما في ذلك إنتاج الطاقة ، واستقلاب الدهون ، وتوازن الكالسيوم ، والتخليق الحيوي للهيم ، وموت الخلايا المنظم ، وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). تعتبر أنواع الأكسجين التفاعلية حيوية للعمليات البيولوجية الرئيسية. ومع ذلك ، عندما لا يتم التحكم فيها ، يمكن أن تؤدي إلى إصابة مؤكسدة ، بما في ذلك تلف الميتوكوندريا. تطلق الميتوكوندريا التالفة المزيد من أنواع الأكسجين التفاعلية ، مما يؤدي إلى تكثيف الإصابة الخلوية وحالة المرض. عملية الاستتباب تسمى الالتهام الذاتي للميتوكوندريا (mitophagy) تزيل بشكل انتقائي الميتوكوندريا التالفة ، والتي يتم استبدالها بعد ذلك بأخرى جديدة. هناك العديد من مسارات الميتوفاجي ، مع نقطة النهاية المشتركة هي انهيار الميتوكوندريا التالفة في الجسيمات الحالة.

تستخدم العديد من المنهجيات ، بما في ذلك أجهزة الاستشعار الجينية ، والتألق المناعي للأجسام المضادة ، والمجهر الإلكتروني ، نقطة النهاية هذه لتحديد الميتوفاجي. كل طريقة لفحص الميتوفاجي لها مزاياها ، مثل استهداف الأنسجة / الخلايا المحددة (مع أجهزة الاستشعار الجينية) والتفاصيل الكبيرة (مع المجهر الإلكتروني). ومع ذلك ، غالبا ما تتطلب هذه الأساليب موارد باهظة الثمن وموظفين مدربين ووقتا طويلا للتحضير قبل التجربة الفعلية ، مثل إنشاء معدلة وراثيا. هنا ، نقدم بديلا فعالا من حيث التكلفة لقياس الميتوفاجي باستخدام أصباغ الفلورسنت المتاحة تجاريا والتي تستهدف الميتوكوندريا والليزوزومات. تقيس هذه الطريقة بشكل فعال الميتوفاجي في الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans وخلايا الكبد البشرية ، مما يشير إلى كفاءتها المحتملة في أنظمة النماذج الأخرى.

Introduction

الميتوكوندريا ضرورية لجميع الحيوانات الهوائية ، بما في ذلك البشر. يقومون بتحويل الطاقة الكيميائية للجزيئات الحيوية إلى أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) عن طريق الفسفرة التأكسدية¹ ، وتوليف الهيم² ، وتحلل الأحماض الدهنية من خلال أكسدة^{β 3} ، وتنظيم توازن الكالسيوم⁴ والحديد⁵ ، والتحكم في موت الخلايا عن طريق موت الخلايا المبرمج⁶ ، وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، والتي تلعب دورا حيويا في توازن الأكسدة^{والاختزال 7}. تحافظ عمليتان متكاملتان ومتعاكستان على سلامة الميتوكوندريا ووظيفتها المناسبة: تخليق ....

Protocol

ملاحظة: من أجل راحة القراء ، قمنا بتقسيم البروتوكول إلى قسمين: أحدهما يركز على بروتوكول قياس الميتوفاجي في C. elegans ، والآخر يركز على بروتوكول قياس الميتوفاجي في خلايا الكبد. يمكن العثور على قائمة المواد في جدول المواد المقدم.

1. بروتوكول C. elegans

1. تحضير صفائح وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) ومخزون بكتيريا الإشريكية القولونية OP50
   ملاحظة: كنقطة توضيح ، بينما اتبعنا البروتوكولات القياسية لإعداد لوحات NGM والمخزون البكتيري OP50^25,26 ، فإننا ندرك أنه قد تكون هناك اختلافات في هذه البروتوكولات بين المختبرات المختل....

النتائج

تحريض استجابة قوية للمريء في كل من ديدان C. elegans وخلايا Hep-3B مع VL-850
يحمي VL-850 ديدان C. elegans والخلايا الكيراتينية البشرية (خلايا HaCaT) من الإجهاد التأكسدي²³. لمزيد من استكشاف آلية عملها ، درسنا ما إذا كان VL-850 يحفز الميتوفاجي في C. elegans والخلايا البشرية الأخرى. ل?.......

Discussion

تتضمن مسارات الميتوفاجي المتعددة بروتينات وجزيئات حيوية مختلفة (على سبيل المثال ، كارديوليبين²⁹). ومع ذلك ، فإن نقطة نهاية هذه المسارات متشابهة - تدهور الميتوكوندريا بواسطة الإنزيمات الليزوزومية^12,13. في الواقع ، تستخدم العديد من الطرق نقطة النه?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent or resource
Analytical balance	Mettler-Toledo
Bacto Agar	BD-Difco	214010
Bacto Peptone	BD-Difco	211677
Bacto Tryptone	BD-Difco	211705
Bacto Yeast extract	BD-Difco	212750
Calcium chloride	Sigma	C1016
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)	Sigma	C2920
Chemicals
Cholestrol	Thermo Fisher	C/5360/48
DMEM high glucose	Biological Industries	01-055-1A
Double distilled water (DDW)
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biological Industries	02-023-1A
FBS heat inactivated	Invitrogen	M7514
Gluteradehyde (25%)	Sigma	G5882
HEPES Buffer 1 M	Biological Industries	03-025-1B
L-gluatamine	Biological Industries	03-020-1B
Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent	Abcam	ab139487
Magnesium Sulfate	Sigma	M7506
Nonidet P 40	Sigma	74385
Paraformalydehyde (16%)	Electron Microscopy Sciences	15720
Poloxamer 188 Solution	Sigma	P5556
Potassium dihydrogen phosphate	Millipore	1.04873.1000
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P3786
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
Sodium Chloride	Bio-Lab	1903059100
Sodium Hydroxide	Gadot	1310732
Sodium phosphate dibasic dodecahydrate	Sigma	4273
Tetracycline hydrochloride	Sigma	87128-25G
Trypsin-EDTA	Biological Industries	03-052-1A
VL-850: 1,8-diaminooxy-octane	Patented
Glass/Plastic Disposables
0.22 μm syringe filter	Millex GV	SLGV033RS
1.7 mL Micro Centrifuge Tubes	Lifegene	LMCT1.7B-500
10 cm Petri plates	Corning	430167
1,000 mL Erlenmeyer Flask	IsoLab, Germany
15 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB15-500
35 mm Petri dishes	Bar Naor	BN9015810
500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm	Lifegene	LG-FPE205500S
50 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB50-500
Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm	Marienfeld	101152
Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass	Pyrex	99445-13
iBiDi 8 well μ-slides	iBiDi	80826
Microscope cover glass 24 x 40 mm	Bar Naor	BN1052421ECALN
Platinum iridium 0.25 mM wire	World Precision Instruments	PT1002
Instruments
Cell counter CellDrop BF	DeNovix	CellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400	Biosan	BS-010201-AAA
Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software	Nikon	CSU-W1
Olympus SZ61 stereo microscope	Olympus	SZ61
pH meter	Mettler-Toledo	MT30019032
Revolver Adjustable Lab Rotator	Labnet	H5600