JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتطلب استكشاف الميتوفاجي من خلال المجهر الإلكتروني وأجهزة الاستشعار الجينية والتألق المناعي معدات مكلفة وموظفين مهرة واستثمارا كبيرا للوقت. هنا ، نوضح فعالية مجموعة صبغة مضان تجارية في تحديد عملية الميتوفاجي في كل من Caenorhabditis elegans وخط خلايا سرطان الكبد.

Abstract

الميتوكوندريا ضرورية لمختلف الوظائف البيولوجية ، بما في ذلك إنتاج الطاقة ، واستقلاب الدهون ، وتوازن الكالسيوم ، والتخليق الحيوي للهيم ، وموت الخلايا المنظم ، وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). تعتبر أنواع الأكسجين التفاعلية حيوية للعمليات البيولوجية الرئيسية. ومع ذلك ، عندما لا يتم التحكم فيها ، يمكن أن تؤدي إلى إصابة مؤكسدة ، بما في ذلك تلف الميتوكوندريا. تطلق الميتوكوندريا التالفة المزيد من أنواع الأكسجين التفاعلية ، مما يؤدي إلى تكثيف الإصابة الخلوية وحالة المرض. عملية الاستتباب تسمى الالتهام الذاتي للميتوكوندريا (mitophagy) تزيل بشكل انتقائي الميتوكوندريا التالفة ، والتي يتم استبدالها بعد ذلك بأخرى جديدة. هناك العديد من مسارات الميتوفاجي ، مع نقطة النهاية المشتركة هي انهيار الميتوكوندريا التالفة في الجسيمات الحالة.

تستخدم العديد من المنهجيات ، بما في ذلك أجهزة الاستشعار الجينية ، والتألق المناعي للأجسام المضادة ، والمجهر الإلكتروني ، نقطة النهاية هذه لتحديد الميتوفاجي. كل طريقة لفحص الميتوفاجي لها مزاياها ، مثل استهداف الأنسجة / الخلايا المحددة (مع أجهزة الاستشعار الجينية) والتفاصيل الكبيرة (مع المجهر الإلكتروني). ومع ذلك ، غالبا ما تتطلب هذه الأساليب موارد باهظة الثمن وموظفين مدربين ووقتا طويلا للتحضير قبل التجربة الفعلية ، مثل إنشاء معدلة وراثيا. هنا ، نقدم بديلا فعالا من حيث التكلفة لقياس الميتوفاجي باستخدام أصباغ الفلورسنت المتاحة تجاريا والتي تستهدف الميتوكوندريا والليزوزومات. تقيس هذه الطريقة بشكل فعال الميتوفاجي في الديدان الخيطية Caenorhabditis elegans وخلايا الكبد البشرية ، مما يشير إلى كفاءتها المحتملة في أنظمة النماذج الأخرى.

Introduction

الميتوكوندريا ضرورية لجميع الحيوانات الهوائية ، بما في ذلك البشر. يقومون بتحويل الطاقة الكيميائية للجزيئات الحيوية إلى أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) عن طريق الفسفرة التأكسدية1 ، وتوليف الهيم2 ، وتحلل الأحماض الدهنية من خلال أكسدةβ 3 ، وتنظيم توازن الكالسيوم4 والحديد5 ، والتحكم في موت الخلايا عن طريق موت الخلايا المبرمج6 ، وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، والتي تلعب دورا حيويا في توازن الأكسدةوالاختزال 7. تحافظ عمليتان متكاملتان ومتعاكستان على سلامة الميتوكوندريا ووظيفتها المناسبة: تخليق مكونات الميتوكوندريا الجديدة (التكوين الحيوي) والإزالة الانتقائية للمكونات التالفة من خلال الالتهام الذاتي للميتوكوندريا (أي الميتوفاجي)8.

يتم التوسط في العديد من مسارات الميتوفاجي بواسطة الإنزيمات ، مثل PINK1 / Parkin ، والمستقبلات ، بما في ذلك FUNDC1 و FKBP8 و BNIP / NIX9،10. والجدير بالذكر أن التدهور الانتقائي لمكونات الميتوكوندريا يمكن أن يحدث بشكل مستقل عن آلية البلعمة الذاتية (أي من خلال الحويصلات المشتقة من الميتوكوندريا)11. ومع ذلك ، فإن نقاط النهاية لمسارات الميتوفاجي الانتقائية المختلفة متشابهة (أي تدهور الميتوكوندريا بواسطة إنزيمات الليزوزومات)12,13. لهذا السبب ، تعتمد الطرق المختلفة لتحديد وقياس الميتوفاجي على التموضع المشترك لعلامات الميتوكوندريا والليزوزومية 14،15،16،17 وانخفاض مستويات بروتينات الميتوكوندريا / الحمض النووي للميتوكوندريا 18.

فيما يلي وصف موجز للمنهجيات التجريبية الحالية لقياس الميتوفاجي في الخلايا الحيوانية باستخدام الفحص المجهري الفلوري ، مع التركيز على مرحلة نقطة نهاية الميتوفاجي.

أجهزة الاستشعار الحيوية Mitophagy
يحدث تدهور الميتوكوندريا داخل البيئة الحمضية للجسيمالليزوزوم 19. لذلك ، تتعرض مكونات الميتوكوندريا ، بما في ذلك البروتينات ، للتحول من الأس الهيدروجيني المحايد إلى الأس الهيدروجيني الحمضي عند نقطة نهاية عملية الميتوفاجي. يدعم هذا النمط آلية عمل العديد من أجهزة الاستشعار الحيوية للميوفاجي ، بما في ذلك mito-Rosella18 والترادف mCherry-GFP-FIS114. تحتوي هذه المستشعرات على بروتين مضان أخضر حساس لدرجة الحموضة (GFP) وبروتين مضان أحمر غير حساس لدرجة الحموضة (RFP). لذلك ، عند نقطة نهاية الميتوفاجي ، تنخفض نسبة التألق الأخضر إلى الأحمر بشكل كبير بسبب إخماد فلوروفور GFP. القيود الرئيسية لهذه المستشعرات هي (1) نقل طاقة الرنين Förster (FRET) بين الفلوروفورات. (2) معدل النضج التفاضلي ل GFP و RFP ؛ (3) التفكك بين GFP و RFP بسبب الانقسام البروتيني للببتيد الذي يربطهما ؛ (4) تداخل الانبعاثات الفلورية ؛ و (5) سطوع الفلوروفور التفاضلي والتبريد15,16.

المستشعر الذي يتغلب على بعض هذه القيود هو مستشعر الميتوكوندريا Keima17. يعرض مستشعر mt-Keima (المشتق من البروتين المرجاني Keima) ذروة انبعاث واحدة (620 نانومتر). ومع ذلك ، فإن قمم الإثارة حساسة لدرجة الحموضة. نتيجة لذلك ، هناك انتقال من الإثارة الخضراء (440 نانومتر) إلى الأحمر (586 نانومتر) عند التحول من درجة الحموضة العالية إلى درجة الحموضة الحمضية16,17. وقد طور جهاز استشعار الميتوفاجي الأحدث ، Mito-SRAI ، المجال من خلال السماح بالقياسات في عينات بيولوجية ثابتة20. ومع ذلك ، على الرغم من المزايا العديدة لأجهزة الاستشعار الجينية ، مثل القدرة على التعبير عنها في أنسجة / خلايا معينة واستهدافها إلى مقصورات الميتوكوندريا المتميزة ، إلا أن لها أيضا قيودا. أحد القيود هو أن أجهزة الاستشعار الجينية تحتاج إلى التعبير عنها في الخلايا أو الحيوانات ، والتي يمكن أن تستغرق وقتا طويلا وكثيفة الموارد.

بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤثر التعبير عن المستشعرات داخل الميتوكوندريا نفسها على وظيفة الميتوكوندريا. على سبيل المثال ، يؤدي التعبير عن GFP للميتوكوندريا (mtGFP) في عضلات جدار جسم دودة C. elegans إلى توسيع شبكة الميتوكوندريا21. يعتمد هذا النمط الظاهري على وظيفة عامل النسخ المنشط بالإجهاد ATFS-1 ، والذي يلعب دورا أساسيا في تنشيط استجابة البروتين غير المطوية في الميتوكوندريا (UPR mt) 21. لذلك ، على الرغم من أن المستشعرات الحيوية للميتوكوندريا / الميتوفاجي المشفرة وراثيا مفيدة للغاية لمراقبة توازن الميتوكوندريا في الجسم الحي ، إلا أنها قد تؤثر على العملية ذاتها المصممة لقياسها.

الأجسام المضادة والأصباغ الخاصة بالميتوكوندريا / الليزوزوم
هناك استراتيجية أخرى لاختبار التوطين المشترك للميتوكوندريا / الليزوزوم وهي استخدام الأجسام المضادة ضد بروتينات الميتوكوندريا / الليزوزومية ، مثل بروتين الغشاء الخارجي للميتوكوندريا TOM20 وبروتين الغشاء المرتبط بالليزوزوم 1 (LAMP1) 22. في معظم الحالات ، يتم استخدام الأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع الفلوروفور للكشف عن إشارة التألق عبر الفحص المجهري. هناك استراتيجية أخرى تتمثل في الجمع بين التركيبات الجينية وأصباغ الميتوكوندريا / الليزوزومية ، مثل التعبير عن بنية اندماج LAMP1::GFP في الخلايا أثناء تلطيخها بصبغة ميتوكوندريا حمراء (على سبيل المثال ، Mitotracker Red)16. تتطلب هذه المنهجيات ، على الرغم من فعاليتها ، أجساما مضادة محددة وغالبا ما تتضمن العمل مع عينات ثابتة أو توليد خلايا / محورة وراثيا تعبر عن الميتوكوندريا / الجسيمات الحالة الفلورية.

هنا ، نوضح استخدام مجموعة تلطيخ الليزوزوم / الميتوكوندريا / النووية التجارية لتقييم خصائص تنشيط الميتوفاجي للديامين الاصطناعي O ، O (أوكتان -1،8-دييل) مكرر (هيدروكسيلامين) ، المشار إليه فيما يلي باسم VL-85023 ، في ديدان C. elegans وخط الخلايا السرطانية البشرية Hep-3B (الشكل 1). تحتوي مجموعة التلوين على مزيج من الأصباغ الليزوزومية / الميتوكوندريا / النووية المستهدفة التي تلطخ هذه العضيات على وجه التحديد23. استخدمنا هذه المجموعة سابقا لإثبات نشاط الميتوفاجي ل 1,8 ديامينوكتان (يشار إليه فيما يلي باسم VL-004) في C. elegans23. الأهم من ذلك ، قمنا بالتحقق من صحة نتائج مجموعة التلوين باستخدام المستشعر الحيوي mito-Rosella وقياسات qPCR للميتوكوندريا: محتوى الحمض النوويالنووي 23. توفر مجموعة التلوين هذه المزايا التالية. أولا ، ليست هناك حاجة لتوليد أو خلايا محورة وراثيا تعبر عن مستشعر حيوي للميتوكوندريا. لذلك ، يمكننا دراسة الحيوانات أو الخلايا البرية غير المعدلة ، وبالتالي توفير الكثير من الوقت والمال والعمل. علاوة على ذلك ، كما ذكرنا ، فإن التعبير عن أجهزة الاستشعار الحيوية للميتوكوندريا يمكن أن يغير وظيفة الميتوكوندريا. ثانيا ، المجموعة فعالة من حيث التكلفة وسهلة الاستخدام وسريعة. ثالثا ، على الرغم من أننا نوضح الطريقة في C. elegans والخلايا البشرية ، إلا أنه يمكن تعديلها لأنواع الخلايا والكائنات الحية الأخرى.

مع ذلك ، مثل أي طريقة ، فإن بروتوكول مجموعة التلوين له عيوب. على سبيل المثال ، يتم تنفيذ حضانة الديدان مع الكاشف في غياب الطعام (لقد رأينا أنه حتى البكتيريا الميتة تقلل بشكل كبير من كفاءة تلطيخ). على الرغم من أن وقت الحضانة قصير نسبيا ، فمن الممكن أنه حتى في هذا الإطار الزمني ، قد تتغير استجابات الاستتباب ، بما في ذلك الميتوفاجي. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤثر ارتباط الأصباغ ببروتينات ER / الميتوكوندريا / النووية والجزيئات الحيوية الأخرى على أنشطة هذه العضيات. علاوة على ذلك ، على عكس قياس الميتوفاجي باستخدام أجهزة الاستشعار الجينية ، فإننا نعمل مع الديدان والخلايا التي خضعت للتثبيت الكيميائي. لذلك ، من المستحيل الاستمرار في مراقبة نفس الديدان / الخلايا في أوقات مختلفة. ومن ثم ، نوصي بدمج منهجيات مختلفة للتحقق من صحة وظيفة الميتوفاجي في عملية فسيولوجية معينة. أدناه ، نقدم بيانات جديدة توضح أن VL-850 يحفز الميتوفاجي القوي في ديدان C. elegans وخلايا Hep-3B. لذلك ، تدعم هذه البيانات الفرضية القائلة بأن VL-850 يطيل عمر C. elegans ويحمي C. elegans من التلف التأكسدي من خلال تحريض mitophagy صحية . لقد استخدمنا سيانيد البروتون الأيونوفور الكربونيل 4- (ثلاثي فلورو روميثوكسي) فينيل هيدرازون (FCCP) ، وهو محفز قوي للميتوفاجي24 ، كعنصر تحكم إيجابي.

Protocol

ملاحظة: من أجل راحة القراء ، قمنا بتقسيم البروتوكول إلى قسمين: أحدهما يركز على بروتوكول قياس الميتوفاجي في C. elegans ، والآخر يركز على بروتوكول قياس الميتوفاجي في خلايا الكبد. يمكن العثور على قائمة المواد في جدول المواد المقدم.

1. بروتوكول C. elegans

  1. تحضير صفائح وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) ومخزون بكتيريا الإشريكية القولونية OP50
    ملاحظة: كنقطة توضيح ، بينما اتبعنا البروتوكولات القياسية لإعداد لوحات NGM والمخزون البكتيري OP5025,26 ، فإننا ندرك أنه قد تكون هناك اختلافات في هذه البروتوكولات بين المختبرات المختلفة. لذلك ، قمنا بتضمين البروتوكولات الكاملة لضمان التكرار الدقيق للتجربة.
    1. اصنع 1 M من محلول فوسفات البوتاسيوم ، pH 6 ، بإضافة ~ 150 مل من 1 M K 2 HPO 4 إلى 500 مل من محلول 1 M KH2PO4 حتى يتم الوصول إلى الرقم الهيدروجيني6. تعقيم المخزن المؤقت عن طريق تمريره عبر مرشح فراغ / نظام تخزين 0.22 ميكرومتر.
    2. اصنع 0.1 متر من كلوريد الكالسيوم (CaCl 2) وكبريتات المغنيسيوم (MgSO4) ، وقم بتعقيمها بفلتر حقنة0.2 ميكرومتر.
    3. تحضير 5 ملغ / مل من الكوليسترول في الإيثانول المطلق.
      ملاحظة: بما أن الكوليسترول محضر في الإيثانول ، فلا تقم بتصفيته.
    4. تحضير NGM-agar عن طريق إذابة 1.5 جم من كلوريد الصوديوم (NaCl) ، و 1.25 جم من الببتون ، و 8.5 جم من أجار في 500 مل من الماء المقطر المزدوج (DDW). الأوتوكلاف واتركه يبرد إلى ~ 55 °C.
    5. في ظل ظروف معقمة ، أضف 12.5 مل من محلول فوسفات البوتاسيوم (الرقم الهيدروجيني 6) ، و 0.5 مل من 0.1 M CaCl2 ، و 0.5 مل من 0.1 M MgSO4 ، و 1 مل من 5 مجم / مل كوليسترول. تخلط جيدا بعد كل إضافة.
    6. أضف 4 مل من NGM-agar المذاب إلى كل لوحة 35 مم. اترك الأطباق طوال الليل لتتجمد في درجة حرارة الغرفة (RT ، ~ 21 درجة مئوية).
    7. لصنع ألواح أجار Luria-Bertani (LB) ، قم بإذابة 5 جم من كلوريد الصوديوم ، و 5 جم من التربتون ، و 2.5 جم من مستخلص الخميرة ، و 7.5 جم من أجار في 400 مل من الماء المقطر منزوع الأيونات (DDW) ، واضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول على 7.0 ، وارفع مستوى الصوت إلى 500 مل مع DDW ، والأوتوكلاف. بمجرد أن يبرد المحلول إلى 55 درجة مئوية ، صب 25 مل من الخليط في كل طبق بتري 90 مم ، واترك الألواح تجف لمدة يومين في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، قم بإخراج بكتيريا OP50 على ألواح LB المجففة من مخزون الجلسرين ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية طوال الليل للحصول على مستعمرات مفردة.
    8. تحضير 2x خميرة التربتون (YT) عن طريق إذابة 8 غرام من التربتون ، و 5 غرام من مستخلص الخميرة ، و 2.5 غرام من كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم) في 0.5 لتر من DDW. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7 ، والأوتوكلاف.
    9. عند التبريد ، قم بتلقيح مستعمرة بكتيريا OP50 من صفيحة LB المخططة حديثا إلى 50 مل من وسط 2x YT في دورق Erlenmeyer سعة 250 مل. رج العبوة عند 37 درجة مئوية و250 دورة في الدقيقة إلى كثافة بصرية (OD600) تبلغ 0.6 تقريبا.
  2. تجهيز المركبة واللوحات التجريبية
    1. أضف 100 ميكرولتر من بكتيريا OP50 إلى مركز كل لوحة NGM-agar مقاس 35 مم. جفف طوال الليل في RT (درجة حرارة الغرفة ، 21 درجة مئوية).
    2. قم بإعداد 0.5 M VL-850 في DMSO ، وقم بتخفيفه إلى 10 mM VL-850 باستخدام المخزن المؤقت M9 (22 mM KH 2 PO 4 ،42 mM Na2HPO 4 ، 86 mM NaCl ، pH 7 ، و 1 mM MgSO 4) 26. تأكد من أن الرقم الهيدروجيني هو 7.0 (إن لم يكن ، معايرة مع 0.1 M HCl) ، وقم بتصفية المحلول باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر. قم بإعداد السيارة كما هو موضح أعلاه ، ولكن بدون الدواء (في هذه الحالة ، VL-850). اصنع 50 مللي متر FCCP في DMSO ، وقم بتخفيفه إلى 1 مللي متر FCCP باستخدام مخزن مؤقت M9 ، وقم بتعقيم المحلول بمرشح حقنة 0.22 ميكرومتر.
    3. أضف 25 ميكرولتر من السيارة (التحكم السلبي) ، FCCP (التحكم الإيجابي ؛ 5 ميكرومتر) ، أو VL-850 (المعالجة التجريبية ؛ 62.5 ميكرومتر) إلى ألواح NGM المصنفة بشكل منفصل على العشب البكتيري.
    4. قم بتغطية الألواح بورق الألمنيوم واتركها لتجف عند RT (درجة حرارة الغرفة ، 21 درجة مئوية). استخدم اللوحات بعد ~ 16 ساعة.
  3. الحصول على الشباب المتزامن C. elegans خنثى
    1. اصنع 1 لتر من المخزن المؤقت M9 مع 22 مللي متر KH 2PO 4 و 42 مللي متر Na2HPO4 و 86 مللي متر كلوريد الصوديوم. تعقيم عن طريق التعقيم ، والسماح لها لتبرد. بمجرد أن تبرد ، أضف 1 مل من 1 mM MgSO4 (0.22 ميكرومتر معقم بالمرشح).
    2. امزج 0.8 مل من 2.5 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم و 1 مل من محلول 5٪ من هيبوكلوريت الصوديوم مع 2.2 مل من DDW لإنشاء محلول هيبوكلوريت قلوي 4 مل (التركيز النهائي 0.5 نيوتن لهيدروكسيد الصوديوم و 1.25٪ لهيبوكلوريت الصوديوم).
    3. اجمع الديدان (خنثى الجاذبية) في أنبوب مخروطي سعة 15 مل عن طريق غسل ألواح NGM ب 1 مل من M9 buffer 3x لضمان جمع جميع الأمهات في الأنبوب.
    4. ترسب الديدان عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة دقيقة واحدة ، وتخلص من المادة الطافية حتى يتبقى حجم 1 مل.
    5. أضف 1 مل من محلول هيبوكلوريت القلوي ، واخلطه عن طريق قلب الأنبوب 5x. دوامة بلطف الأنبوب لمدة 3 دقائق للمساعدة في إطلاق البيض ، ومراقبة حالة الديدان تحت مجسمة تشريح.
    6. عندما يتم كسر ما يقرب من 50 ٪ من الديدان ، أضف 5 مل من المخزن المؤقت M9 وترسب البيض على الفور عن طريق الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة عند 500 × جم.
    7. قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات. أضف 5 مل من المخزن المؤقت M9 ، وكرر إجراء الغسيل 2x.
    8. قم بإزالة المادة الطافية حتى يتبقى 2 مل ، وقم بتدوير الأنبوب (دوران 360 درجة) عند 20 دورة في الدقيقة لمدة ~ 16 ساعة (RT ، 21 درجة مئوية) للحصول على يرقات L1 متزامنة. من هذا الأنبوب ، خذ قطرة 5 ميكرولتر على شريحة زجاجية ، واحسب عدد اليرقات تحت مجسمة ، وكرر هذه الخطوة 3x ، وخذ متوسط التهم الثلاثة ، وقدر عدد الديدان لكل ميكرولتر (ميكرولتر). بناء على هذه الحسابات ، أضف ~ 200 يرقة لكل صفيحة NGM مصنفة ببكتيريا OP50.
    9. تنمو يرقات L1 عند 21 درجة مئوية لمدة ~ 48 ساعة حتى مرحلة الشباب.
  4. العلاج من تعاطي المخدرات وإجراء الفحص المجهري
    1. ضع 100 دودة على كل من اللوحات التجريبية أو التحكم. تأكد من أن اللوحات السلبية والإيجابية والتجريبية تحتوي على السيارة ، 5 ميكرومتر FCCP ، و 62.5 ميكرومتر VL-850 ، على التوالي. احتضان في 21 درجة مئوية لمدة 6 ساعات.
    2. استخدم 1 مل من المخزن المؤقت M9 لغسل الديدان من كل لوحة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 مل. قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة (~ 3 ثوان) في جهاز طرد مركزي صغير. بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية عن طريق سحب المخزن المؤقت M9 برفق دون إزعاج حبيبات الدودة. كرر خطوة الغسيل هذه 2x ، ثم قم بإزالة المادة الطافية برفق دون إزعاج حبيبات الدودة.
    3. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 ، والذي يحتوي على 0.1٪ v / v Poloxamer 188 ، 0.1٪ v / v Pluronic F127 ، و 2 ميكرولتر من كاشف مجموعة التلوين ، إلى حبيبات الدودة. دع الخليط يدور عند 20 دورة في الدقيقة (دوران 360 درجة) لمدة 1 ساعة عند RT (درجة حرارة الغرفة ، 21 درجة مئوية). لحماية الأصباغ من الضوء ، قم بتغطية الأنابيب بورق الألمنيوم.
    4. أدر الديدان برفق ، كما هو موضح في الخطوة 1.3.4. ثم قم بإزالة محلول التلوين دون إزعاج حبيبات الدودة. بعد ذلك ، اغسل الديدان كما هو موضح في الخطوة 1.3.2 ، وانقلها إلى صفيحة NGM-agar مصنفة تحتوي على العلاج المناسب - على سبيل المثال ، يتم نقل الديدان المعالجة ب FCCP إلى لوحة تحتوي على FCCP. قم بتغطية الألواح بورق الألمنيوم لأن كاشف التلوين حساس للضوء.
      ملاحظة: قمنا بنقل الديدان إلى لوحات الاستزراع التي تحتوي على البكتيريا وعامل المعالجة المقابل لتقليل ضوضاء الخلفية بسبب الصبغة الزائدة. على سبيل المثال ، تم نقل الديدان المعالجة ب FCCP إلى لوحات مكملة ب FCCP ، وهكذا دواليك.
    5. اغسل الديدان من الألواح في أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة باستخدام 1 مل من المخزن المؤقت M9 ؛ اغسل الديدان بنفس الطريقة 2x. بعد ذلك ، ثبت الديدان بنسبة 1٪ فورمالديهايد على الجليد لمدة 30 دقيقة ، واغسل الديدان ب 1 مل من M9 buffer 3x لإزالة الفورمالديهايد المتبقي. بعد الغسيل ، قم بتدوير الديدان إلى حبيبات ، واستنشاق أكبر قدر ممكن من المادة الطافية ، مع الحفاظ على حبيبات الدودة سليمة في 10 ميكرولتر من M9.
    6. لتحضير 2.5٪ من الأغاروز ، قم بوزن 0.125 جم من الأغاروز في أنبوب اختبار زجاج البورسليكات سعة 10 مل ، وأضف 5 مل من المخزن المؤقت M9 ، وقم بإذابة الأغاروز عن طريق تسخين الأنبوب برفق باستخدام موقد بنسن. انقل الأغاروز المذاب إلى حمام جاف على حرارة 75 درجة مئوية ، وباستخدام طرف 1 مل ، ضع 100 ميكرولتر من الأغاروز المذاب على زجاج غطاء مجهر Deckgläser (24 مم × 60 مم). على الفور ، ضع شريحة أخرى بشكل عمودي على قطرة الأغاروز ، لتشكيل شكل متقاطع. انتظر ~ 2 دقيقة ، وافصل الشرائح برفق عن طريق (برفق) دفع زجاج الغطاء العلوي ، وبالتالي ترك وسادة الأغاروز على شريحة الغطاء السفلي.
      ملاحظة: كن حذرا أثناء تسخين الأغاروز في الأنبوب ، وتأكد من إبقاء الأنبوب بعيدا عن الجسم. قطع حافة طرف 1 مل لتقليل تخثر الأغاروز.
    7. انقل الديدان إلى وسادة الأغاروز باستخدام ماصة زجاجية باستور (أي الكمية الكاملة في الأنبوب ، ~ 10 ميكرولتر). قم بإزالة السائل الزائد بفتيل مصنوع من مسح المختبر ، ثم قم بتغطية الديدان بشريحة غطاء أصغر (24 مم × 40 مم). ضع طلاء أظافر شفاف على محيط شريحة الغطاء الأصغر لمنع التبخر. ضع الشريحة في صندوق مظلم لحمايتها من الضوء.
    8. استخدم مجهرا متحد البؤر لتصوير الديدان في غضون 24 ساعة عند الأطوال الموجية المناسبة (انظر أدناه) باستخدام عدسة تكبير 60x.
      1. ضع الشريحة على مرحلة المجهر.
      2. افتح برنامج التصوير ، وانقر بزر الماوس الأيمن على المنطقة الرمادية من البرنامج. الاستحواذ المفتوح | Ti2 وسادة كاملة | الاستحواذ على ND | جداول البحث من خلال النقر على الخيارات الموجودة في النافذة المنبثقة التي تظهر نتيجة للنقر بزر الماوس الأيمن.
      3. ضمن Ti2 Full Pad، حدد 60x.
      4. ضمن الاكتساب، حدد Eyepiece DIA، وقم بالتركيز على الديدان باستخدام مقبض التركيز الدقيق للمجهر. ضمن اكتساب، حدد قرص دوار، واختر الخيار 16 بت - بدون تجميع. لكل مرشح مضان ، اضبط وقت التعرض على 500 مللي ثانية و 20 مللي ثانية ل Brightfield. بمجرد تعيين هذه المعلمات ، حدد تشغيل الآن ، وانتظر حتى يتم إنشاء صورة الإخراج كملف ND2.
        ملاحظة: يجب تحديد وقت التعرض تجريبيا ، حيث أن إعدادات التصوير المختلفة لها خصائص مختلفة. استخدم جداول البحث (LUTs) لفحص شدة التألق لكل طول موجي.
  5. تحليل الصور
    1. افتح الصور متحدة البؤر (هنا، ملفات نيكون ND2) في ImageJ27 باستخدام المكون الإضافي colocalization. يحتوي كل ملف ND على مستويات صور تم التقاطها بثلاثة أطوال موجية (باستخدام مرشحات DAPI و GFP / FETC [أخضر] وتكساس الأحمر [الأحمر]) والضوء المرئي. للوصول إلى تلك الصور، افتح ملف ND في خادم ImageJ، وحدد تقسيم الصور في الشاشة. العمل مع برايتفيلد (BF) والقناة الخضراء وصور القناة الحمراء.
    2. قم بإنشاء نسخ مكررة من هذه الصور للحفاظ على الصورة الأصلية دون تغيير بالنقر فوق صورة | تكرار أو استخدام اختصار لوحة المفاتيح Shift + D.
    3. لتقليل الخلفية ، قم بإنشاء نسخة مكررة أخرى من الصورة ، كما هو مذكور أعلاه. اطرح الخلفية بنصف قطر دوار يبلغ 100 ، وحدد خيار إنشاء خلفية (لا تطرح) لإنشاء صورة بخلفية الصورة المحددة. بعد ذلك ، انتقل إلى العملية | حاسبة الصور ، واطرح أول صورة مكررة من الصورة المكررة الثانية. استخدم الصور الناتجة لتحليل colocalization.
    4. لاستخدام المكون الإضافي colocalization ، قم بتحويل صور القناة الخضراء والقناة الحمراء إلى 8 بت. للقيام بذلك ، انقر فوق صورة | النوع | 8 بت.
    5. انقر فوق الإضافات | التوطين المشترك. لقياس التمركز المشترك لإشارات الميتوكوندريا والليزوزوم باستخدام المكون الإضافي colocalization (انظر أعلاه) ، استخدم المعلمات التالية: النسبة = 75٪ ، عتبة القناة الحمراء = 80.0 ، عتبة القناة الخضراء = 50.0. الإخراج عبارة عن صورة ثنائية 8 بت تحتوي على puncta colocalized ومجموعة من الصور الثلاث ذات 8 بت (الأخضر والأحمر والصورة المترجمة) في صورة RGB.
    6. ركز على النقاط الموجودة في عضلة جدار الجسم والرأس للديدان عن طريق تحديد هذه المنطقة يدويا وإنشاء قناع بالنقر فوق تحرير | الاختيار | إنشاء قناع ، والذي يحدد منطقة الاهتمام (الشكل 2 أ ، ب). قم بإزالة الكيانات الملطخة الأخرى بشكل انتقائي (مثل عضلات البلعوم) لتحليل منطقة عضلات جدار الجسم والرأس.
    7. لتحديد الجسيمات في منطقة الاهتمام (ROI) ، حدد 8 بت المترجمة وإخفاء الصور باستخدام حاسبة الصور. بعد ذلك ، استخدم العملية AND (الشكل 3 أ) لتحديد النقطة في عائد الاستثمار. يؤدي هذا إلى إنشاء صورة ذات نقطة في عائد الاستثمار (الشكل 3 ب).
    8. لتحليل منطقة الميتوكوندريا والليزوزومات الموضعية ، حدد تحليل | تحليل الجسيمات ، وقياس مجموع النقاط بين 0.1625 ميكرومتر 2 و 4 ميكرومتر2.

2. بروتوكول الخلايا السرطانية Hep-3B

  1. تحضير محلول مخزون الدواء
    1. تحضير 100 mM VL-850 في DMSO. قم بتخفيفه إلى 5 مللي متر باستخدام محلول HEPES 0.5 M ، ودرجة الحموضة 7.3 ، وقم بتعقيم المحلول باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر. ثم ، قم بإعداد السيارة كما هو موضح من قبل ، ولكن بدون الدواء (في هذه الحالة ، VL-850).
  2. زراعة خلايا Hep-3B للتجربة والعلاج الدوائي وإجراء الفحص المجهري
    1. تنمو خلايا Hep-3B في ألواح زراعة الأنسجة 10 سم التي تحتوي على وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) المكمل ب 10٪ مصل بقري جنيني معطل بالحرارة (FBS) ، و 2٪ L-glutamine ، و 1٪ تتراسيكلين (يشار إليه فيما يلي باسم DMEM الكامل). احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    2. اختر صفيحة من خلايا Hep-3B تعرض التقاء خلايا 70٪ -80٪ (مرحلة النمو اللوغاريتمي) ، وقم بإزالة الوسط ، واغسل اللوحة ب 5 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). إزالة برنامج تلفزيوني ، واحتضان الخلايا مع 1 مل من التسخين المسبق 0.25 ٪ تربسين / 0.02 ٪ EDTA لمدة ~ 3 دقائق في 37 °C ؛ مراقبة الخلايا تحت مجهر زراعة الأنسجة (10x). أوقف هضم التربسين عندما تصبح الخلايا مستديرة وابدأ في الانفصال عن اللوحة بإضافة 5 مل من DMEM الكامل. قم بطرد الخلايا عند 1000 × جم لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 5 مل من DMEM الكامل.
    3. تحديد تركيز الخلية. امزج 50 ميكرولتر من تعليق الخلية مع 50 ميكرولتر من التريبان الأزرق. عد الخلايا باستخدام عداد خلية آلي أو باستخدام مقياس الدم 5x ، وخذ متوسط هذه الأعداد لضمان دقة العد.
    4. قم بزرع 42000 خلية Hep3G في كل شريحة μ 8 آبار في 400 ميكرولتر من DMEM الكامل (كما هو موضح أعلاه). احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    5. بعد 24 ساعة عند التقاء ~ 80٪ -85٪ ، قم بإزالة 250 ميكرولتر من الوسط من كل بئر ، وأضف 50 ميكرولتر من الوسط مع المعالجة أو السيارة المناسبة. لاتباع هذا البروتوكول ، تعامل مع الخلايا باستخدام 100 ميكرومتر VL-850 و 5 ميكرومتر FCCP ومركبة كعنصر تحكم.
    6. بعد حضانة 6 ساعات مع المركبات ، أضف 50 ميكرولتر من الوسط إلى كل بئر يحتوي على كاشف التلوين (0.5 ميكرولتر من الصبغة مقابل 250 ميكرولتر في كل بئر). احتضان الخلايا بالصبغة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
      ملاحظة: نظرا لأن كاشف التلوين حساس للضوء ، قلل من التعرض للضوء عن طريق تغطية العينات بورق الألمنيوم والعمل في بيئة خافتة (إن أمكن).
    7. باستخدام ماصة 200 ميكرولتر ، قم بإزالة كل الوسط (250 ميكرولتر) برفق من كل بئر ، ثم اغسل الخلايا ب 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مسخن مسبقا.
    8. ثبت الخلايا ب 200 ميكرولتر من محلول التثبيت الذي يحتوي على 4٪ فورمالديهايد و 2.5٪ جلوتارالدهيد محضر في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في RT.
    9. صب المحلول المثبت ، واغسله لفترة وجيزة باستخدام 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
    10. أضف 200 ميكرولتر من PBS ، وحافظ على الخلايا مغطاة ومحمية من الضوء عند 4 درجات مئوية ، والصورة في غضون 24 ساعة.
      ملاحظة: استخدمنا المجهر متحد البؤر للقرص الدوار في أربع قنوات ، بما في ذلك DIC و TRITC و FITC و DAPI ، كما في الخطوة 1.4.8. قمنا بتصوير ~ 300 خلية لكل علاج.
  3. تحليل الصور
    1. قم بتنفيذ الخطوات 1.5.1-1.5.5. للحصول على عائد الاستثمار للخلايا ، قم بإنشاء صورة تبرز منطقة الخلايا. لهذا ، اختر صورة نقاط مترجمة (RGB) (الشكل 4 أ). لتحديد منطقة الخلية بأكملها، حدد معالجة | ثنائي | قم بإنشاء قناع للحصول على صورة ثنائية (الشكل 4 ب). لتحليل مساحة الخلية، حدد تحليل | تحليل الجسيمات ، وقياس جميع الجسيمات في الصورة من 0 إلى ما لا نهاية ، وهو الإعداد الافتراضي لتحليل الجسيمات.
    2. لتحليل مساحة الميتوكوندريا والليزوزومات المتمركزة ، حدد صورة 8 بت مشتركة ، وقم بتحويلها إلى ثنائي عن طريق تحديد حدد عملية | ثنائي | إنشاء ثنائي، حدد تحليل | تحليل الجسيمات ، وقياس جمع النقاط بين 0.1625 ميكرومتر 2 و 4 ميكرومتر2. لقياس النقاط الموضعية ، قسم مساحة الميتوكوندريا والليزوزومات على إجمالي مساحة الخلية.

النتائج

تحريض استجابة قوية للمريء في كل من ديدان C. elegans وخلايا Hep-3B مع VL-850
يحمي VL-850 ديدان C. elegans والخلايا الكيراتينية البشرية (خلايا HaCaT) من الإجهاد التأكسدي23. لمزيد من استكشاف آلية عملها ، درسنا ما إذا كان VL-850 يحفز الميتوفاجي في C. elegans والخلايا البشرية الأخرى. ل?...

Discussion

تتضمن مسارات الميتوفاجي المتعددة بروتينات وجزيئات حيوية مختلفة (على سبيل المثال ، كارديوليبين29). ومع ذلك ، فإن نقطة نهاية هذه المسارات متشابهة - تدهور الميتوكوندريا بواسطة الإنزيمات الليزوزومية12,13. في الواقع ، تستخدم العديد من الطرق نقطة النه?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgements

نشكر أعضاء مختبر جروس على القراءة النقدية للمخطوطة وتعليقاتهم ونصائحهم. نشكر مركز Caenorhabditis Genetics Center (CGC) ، الذي يموله مكتب المعاهد الوطنية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440) ، لتوفير بعض السلالات. تم دعم هذا البحث بمنحة من شركة Vitalunga Ltd وصندوق العلوم الإسرائيلي (منحة رقم 989/19). تم إنشاء الشكل التجريدي الرسومي (الشكل 1) باستخدام BioRender.com.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent or resource
Analytical balanceMettler-Toledo
Bacto AgarBD-Difco214010
Bacto PeptoneBD-Difco211677
Bacto TryptoneBD-Difco211705
Bacto Yeast extractBD-Difco212750
Calcium chlorideSigmaC1016
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)SigmaC2920
Chemicals
CholestrolThermo FisherC/5360/48
DMEM high glucoseBiological Industries01-055-1A
Double distilled water (DDW)
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)Biological Industries02-023-1A
FBS heat inactivatedInvitrogenM7514
Gluteradehyde (25%)SigmaG5882
HEPES Buffer 1 MBiological Industries03-025-1B
L-gluatamineBiological Industries03-020-1B
Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter ReagentAbcamab139487
Magnesium SulfateSigmaM7506
Nonidet P 40Sigma74385
Paraformalydehyde (16%)Electron Microscopy Sciences15720
Poloxamer 188 SolutionSigmaP5556
Potassium dihydrogen phosphateMillipore1.04873.1000
Potassium phosphate dibasicSigmaP3786
SeaKem LE AgaroseLonza50004
Sodium ChlorideBio-Lab1903059100
Sodium HydroxideGadot1310732
Sodium phosphate dibasic dodecahydrateSigma4273
Tetracycline hydrochlorideSigma87128-25G
Trypsin-EDTABiological Industries03-052-1A
VL-850: 1,8-diaminooxy-octanePatented
Glass/Plastic Disposables
0.22 μm syringe filterMillex GVSLGV033RS
1.7 mL Micro Centrifuge TubesLifegeneLMCT1.7B-500
10 cm Petri platesCorning430167
1,000 mL Erlenmeyer FlaskIsoLab, Germany
15 mL Sterile Polypropylene tubeLifegeneLTB15-500
35 mm Petri dishesBar NaorBN9015810
500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μmLifegeneLG-FPE205500S
50 mL Sterile Polypropylene tubeLifegeneLTB50-500
Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mmMarienfeld101152
Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glassPyrex99445-13
iBiDi 8 well μ-slidesiBiDi80826
Microscope cover glass 24 x 40 mmBar NaorBN1052421ECALN
Platinum iridium 0.25 mM wireWorld Precision InstrumentsPT1002
Instruments
Cell counter CellDrop BFDeNovixCellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400BiosanBS-010201-AAA
Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements softwareNikonCSU-W1
Olympus SZ61 stereo microscopeOlympusSZ61
pH meterMettler-ToledoMT30019032
Revolver Adjustable Lab RotatorLabnetH5600

References

  1. Westermann, B. Molecular machinery of mitochondrial fusion and fission. Journal of Biological Chemistry. 283 (20), 13501-13505 (2008).
  2. Piel, R. B., Dailey, H. A., Medlock, A. E. The mitochondrial heme metabolon: Insights into the complex(ity) of heme synthesis and distribution. Molecular Genetics and Metabolism. 128 (3), 198-203 (2019).
  3. Houten, S. M., Violante, S., Ventura, F. V., Wanders, R. J. A. The biochemistry and physiology of mitochondrial fatty acid β-oxidation and its genetic disorders. Annual Review of Physiology. 78, 23-44 (2016).
  4. Jung, S., et al. Mitofusin 2, a mitochondria-ER tethering protein, facilitates osteoclastogenesis by regulating the calcium-calcineurin-NFATc1 axis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (1), 202-208 (2019).
  5. Carraway, M. S., Suliman, H. B., Madden, M. C., Piantadosi, C. A., Ghio, A. J. Metabolic capacity regulates iron homeostasis in endothelial cells. Free Radical Biology and Medicine. 41 (11), 1662-1669 (2006).
  6. Armstrong, J. S. Mitochondrial medicine: Pharmacological targeting of mitochondria in disease. British Journal of Pharmacology. 151 (8), 1154-1165 (2007).
  7. Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 505-513 (2010).
  8. Palikaras, K., Tavernarakis, N. Mitochondrial homeostasis: The interplay between mitophagy and mitochondrial biogenesis. Experimental Gerontology. 56, 182-188 (2014).
  9. Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20, 31-42 (2013).
  10. Bhujabal, Z., et al. FKBP8 recruits LC3A to mediate Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 18 (6), 947-961 (2017).
  11. Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
  12. Zimmermann, M., Reichert, A. S. How to get rid of mitochondria: Crosstalk and regulation of multiple mitophagy pathways. Biological Chemistry. 399 (1), 29-45 (2017).
  13. Almacellas, E., et al. Lysosomal degradation ensures accurate chromosomal segregation to prevent chromosomal instability. Autophagy. 17 (3), 796-813 (2021).
  14. Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
  15. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  16. Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
  17. Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12, 1576-1587 (2017).
  18. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
  19. Yim, W. W. -. Y., Mizushima, N. Lysosome biology in autophagy. Cell Discovery. 6, 6 (2020).
  20. Katayama, H., et al. Visualizing and modulating mitophagy for therapeutic studies of neurodegeneration. Cell. 181 (5), 1176-1187 (2020).
  21. Shpilka, T., et al. UPR(mt) scales mitochondrial network expansion with protein synthesis via mitochondrial import in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 12, 479 (2021).
  22. Liao, Z., et al. The degradation of TMEM166 by autophagy promotes AMPK activation to protect SH-SY5Y cells exposed to MPP(). Cells. 11 (17), 2706 (2022).
  23. Srivastava, V., et al. Distinct designer diamines promote mitophagy, and thereby enhance healthspan in C. elegans and protect human cells against oxidative damage. Autophagy. 19 (2), 474-504 (2022).
  24. Georgakopoulos, N. D., Wells, G., Campanella, M. The pharmacological regulation of cellular mitophagy. Nature Chemical Biology. 13 (2), 136-146 (2017).
  25. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  26. Wood, W. B. . The Nematode Caenorhabditis Elegans. , (1988).
  27. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  28. Knowles, B. B., Howe, C. C., Aden, D. P. Human hepatocellular carcinoma cell lines secrete the major plasma proteins and hepatitis B surface antigen. Science. 209 (4455), 497-499 (1980).
  29. Antón, Z., et al. Human Atg8-cardiolipin interactions in mitophagy: Specific properties of LC3B, GABARAPL2 and GABARAP. Autophagy. 12 (12), 2386-2403 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

195 Caenorhabditis elegans Hep 3B

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved