JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

חקר מיטופגיה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, חיישנים גנטיים ואימונופלואורסנציה דורש ציוד יקר, כוח אדם מיומן והשקעת זמן משמעותית. כאן, אנו מדגימים את היעילות של ערכת צבע פלואורסצנטית מסחרית בכימות תהליך המיטופגיה הן ב- Caenorhabditis elegans והן בקו תאים לסרטן הכבד.

Abstract

מיטוכונדריה חיוניים לתפקודים ביולוגיים שונים, כולל ייצור אנרגיה, מטבוליזם של שומנים, הומאוסטזיס סידן, ביוסינתזה של הם, מוות תאי מווסת ויצירת מיני חמצן תגובתי (ROS). ROS חיוניים לתהליכים ביולוגיים מרכזיים. עם זאת, כאשר הם אינם מבוקרים, הם עלולים להוביל לפגיעה חמצונית, כולל נזק למיטוכונדריה. מיטוכונדריה פגועים משחררים יותר ROS, ובכך מגבירים את הפגיעה התאית ואת מצב המחלה. תהליך הומיאוסטטי בשם אוטופגיה מיטוכונדריאלית (מיטופגיה) מסיר באופן סלקטיבי מיטוכונדריה פגומים, אשר מוחלפים בחדשים. ישנם מסלולי מיטופגיה מרובים, כאשר נקודת הקצה הנפוצה היא פירוק המיטוכונדריה הפגועה בליזוזומים.

מספר מתודולוגיות, כולל חיישנים גנטיים, אימונופלואורסנציה של נוגדנים ומיקרוסקופ אלקטרונים, משתמשות בנקודת קצה זו כדי לכמת מיטופגיה. לכל שיטה לבדיקת מיטופגיה יתרונות משלה, כגון מיקוד רקמות/תאים ספציפיים (עם חיישנים גנטיים) ופירוט רב (במיקרוסקופ אלקטרונים). עם זאת, שיטות אלה דורשות לעתים קרובות משאבים יקרים, כוח אדם מיומן, וזמן הכנה ארוך לפני הניסוי עצמו, כגון ליצירת בעלי חיים טרנסגניים. כאן, אנו מציגים חלופה חסכונית למדידת מיטופגיה באמצעות צבעים פלואורסצנטיים הזמינים מסחרית המכוונים למיטוכונדריה וליזוזומים. שיטה זו מודדת ביעילות מיטופגיה בנמטודה Caenorhabditis elegans ובתאי כבד אנושיים, מה שמצביע על יעילותה הפוטנציאלית במערכות מודל אחרות.

Introduction

מיטוכונדריה חיוניים לכל בעלי החיים האירוביים, כולל בני אדם. הם ממירים את האנרגיה הכימית של ביומולקולות לאדנוזין טריפוספט (ATP) באמצעות זרחן חמצוני1, מסנתזים הם2, מפרקים חומצות שומן באמצעות חמצון β3, מווסתים הומאוסטזיס סידן4 וברזל5, שולטים במוות תאי על ידי אפופטוזיס6, ומייצרים מיני חמצן תגובתי (ROS), הממלאים תפקיד חיוני בהומאוסטזיס חיזור7. שני תהליכים משלימים ומנוגדים שומרים על שלמות ותפקוד תקין של המיטוכונדריה: סינתזה של רכיבים מיטוכונדריאליים חדשים (ביוגנזה) והסרה סלקטיבית של רכיבים פגומים באמצעות אוטופגיה מיטוכונדריאלית (כלומר, מיטופגיה)8.

מספר מסלולי מיטופגיה מתווכים על ידי אנזימים, כגון PINK1/Parkin, וקולטנים, כולל FUNDC1, FKBP8 ו-BNIP/NIX 9,10. יש לציין כי פירוק סלקטיבי של רכיבים מיטוכונדריאליים יכול להתרחש ללא תלות במנגנון האוטופגוזום (כלומר, באמצעות שלפוחיות שמקורן במיטוכונדריה)11. עם זאת, נקודות הקצה של מסלולי המיטופגיה הסלקטיביים השונים דומות (כלומר, פירוק מיטוכונדריאלי על ידי אנזימים ליזוזומליים)12,13. מסיבה זו, שיטות שונות לזיהוי ומדידה של מיטופגיה מסתמכות על קולוקליזציה של סמנים מיטוכונדריאליים וליזוזומליים 14,15,16,17 וירידה ברמות החלבונים המיטוכונדריאליים/DNA מיטוכונדריאלי 18.

להלן תיאור תמציתי של מתודולוגיות הניסוי הקיימות למדידת מיטופגיה בתאי בעלי חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, תוך שימת דגש על שלב נקודת הקצה של המיטופגיה.

חיישנים ביולוגיים של מיטופגיה
התפרקות מיטוכונדריאלית מתרחשת בסביבה החומצית של הליזוזום19. לכן, רכיבים מיטוכונדריאליים, כולל חלבונים, חווים מעבר מ- pH נייטרלי ל- pH חומצי בנקודת הקצה של תהליך המיטופגיה. דפוס זה עומד בבסיס מנגנון הפעולה של מספר חיישנים ביולוגיים מיטופגיים, כולל מיטו-רוזלה18 וטנדם mCherry-GFP-FIS114. חיישנים אלה מכילים חלבון פלואורסצנטי ירוק רגיש ל- pH (GFP) וחלבון פלואורסצנטי אדום שאינו רגיש ל- pH (RFP). לכן, בנקודת הקצה של המיטופגיה, יחס הפלואורסצנטיות הירוק לאדום יורד באופן משמעותי עקב המרווה של פלואורופור GFP. המגבלות העיקריות של חיישנים אלה הן: (1) העברת אנרגיית תהודה אפשרית של Förster (FRET) בין הפלואורופורים; (2) קצב ההבשלה הדיפרנציאלי של GFP ו-RFP; (3) דיסוציאציה בין GFP לבין RFP עקב שסע פרוטאוליטי של הפוליפפטיד המחבר ביניהם; (4) חפיפה פלואורסצנטית-פליטה; (5) בהירות פלואורופור דיפרנציאלית ומרווה15,16.

חיישן שמתגבר על חלק מהמגבלות הללו הוא חיישן המיטוכונדריהKeima 17. חיישן mt-Keima (הנגזר מחלבון האלמוגים Keima) מציג שיא פליטה יחיד (620 ננומטר). עם זאת, שיאי העירור שלו רגישים ל- pH. כתוצאה מכך, יש מעבר מעיור ירוק (440 ננומטר) לעירור אדום (586 ננומטר) בעת מעבר מ- pH גבוה ל- pH חומצי16,17. חיישן מיטופגי עדכני יותר, Mito-SRAI, קידם את התחום בכך שהוא מאפשר מדידות בדגימות ביולוגיות קבועות20. עם זאת, למרות היתרונות הרבים של חיישנים גנטיים, כגון היכולת לבטא אותם ברקמות/תאים ספציפיים ולמקד אותם למדורים מיטוכונדריאליים נפרדים, יש להם גם מגבלות. מגבלה אחת היא שהחיישנים הגנטיים צריכים לבוא לידי ביטוי בתאים או בבעלי חיים, מה שיכול לגזול זמן רב ומשאבים רבים.

בנוסף, ביטוי החיישנים בתוך המיטוכונדריה עצמם עשוי להשפיע על תפקוד המיטוכונדריה. לדוגמה, ביטוי GFP מיטוכונדריאלי (mtGFP) בשרירי דופן הגוף של תולעת C. elegans מרחיב את הרשת המיטוכונדריאלית21. פנוטיפ זה תלוי בתפקודו של גורם השעתוק ATFS-1 המופעל על ידי מתח, אשר ממלא תפקיד חיוני בהפעלת תגובת חלבון מקופלת במיטוכונדריה (UPRmt)21. לכן, למרות שחיישנים ביולוגיים של מיטוכונדריה/מיטופגיה המקודדים גנטית שימושיים ביותר לניטור הומאוסטזיס מיטוכונדריה in vivo, הם עשויים להשפיע על התהליך שהם נועדו למדוד.

נוגדנים וצבעים ספציפיים למיטוכונדריה/ליזוזום
אסטרטגיה נוספת לבדיקת לוקליזציה מיטוכונדריאלית/ליזוזומית היא שימוש בנוגדנים נגד חלבונים מיטוכונדריאליים/ליזוזומליים, כגון חלבון הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה TOM20 וחלבון קרום ליזוזומלי 1 (LAMP1)22. ברוב המקרים, נוגדנים משניים המצומדים לפלואורופור משמשים לזיהוי אות הפלואורסצנטיות באמצעות מיקרוסקופיה. אסטרטגיה נוספת היא לשלב מבנים גנטיים עם צבעים מיטוכונדריאליים/ליזוזומליים, כגון ביטוי מבנה היתוך LAMP1::GFP בתאים תוך צביעתם בצבע מיטוכונדריאלי אדום (למשל, Mitotracker Red)16. מתודולוגיות אלה, למרות יעילותן, דורשות נוגדנים ספציפיים ולעתים קרובות כוללות עבודה עם דגימות קבועות או יצירת תאים/בעלי חיים טרנסגניים המבטאים מיטוכונדריה/ליזוזומים המסומנים באופן פלואורסצנטי.

במאמר זה אנו מתארים את השימוש בערכת צביעה מסחרית של ליזוזומים/מיטוכונדריה/גרעינים להערכת התכונות מפעילות המיטופגיה של דיאמין סינתטי O,O (אוקטן-1,8-דיל)ביס (הידרוקסילאמין), המכונה להלן VL-85023, בתולעי C. elegans ובקו תאי הסרטן האנושי Hep-3B (איור 1). ערכת הצביעה מכילה תערובת של צבעים ליזוזומליים/מיטוכונדריאליים/גרעיניים המכתימים באופן ספציפי אברונים אלה23. בעבר השתמשנו בערכה זו כדי להדגים את פעילות המיטופגיה של 1,8 דיאמינואוקטן (להלן VL-004) ב-C. elegans23. חשוב לציין, תיקפנו את תוצאות ערכת הצביעה עם מדידות המיטו-רוזלה biosensor ו-qPCR של תכולת ה-DNA המיטוכונדריאלי:גרעיני23. ערכת צביעה זו מציעה את היתרונות הבאים. ראשית, אין צורך לייצר בעלי חיים או תאים טרנסגניים המבטאים ביוסנסור מיטוכונדריאלי. לכן, אנו יכולים לחקור חיות או תאים מסוג בר שלא שונו, ובכך לחסוך הרבה זמן, כסף ועבודה. יתר על כן, כאמור, ביטוי ביו-חיישנים מיטוכונדריאליים יכול לשנות את תפקוד המיטוכונדריה. שנית, הערכה חסכונית, קלה לשימוש ומהירה. שלישית, למרות שאנו מדגימים את השיטה ב-C. elegans ובתאים אנושיים, ניתן לשנות אותה עבור סוגי תאים ואורגניזמים אחרים.

עם זאת, כמו כל שיטה, לפרוטוקול ערכת הצביעה יש חסרונות. לדוגמה, הדגירה של התולעים עם מגיב מתבצעת בהיעדר מזון (ראינו כי אפילו חיידקים מתים להפחית באופן משמעותי את יעילות הצביעה). למרות שזמן הדגירה קצר יחסית, ייתכן שגם בטווח זמן זה ייתכנו שינויים בתגובות ההומיאוסטטיות, כולל מיטופגיה. בנוסף, קשירת הצבעים לחלבון ER/מיטוכונדריה/גרעין וביומולקולות אחרות עשויה להשפיע על פעילותם של אברונים אלה. יתר על כן, בניגוד למדידת מיטופגיה באמצעות חיישנים גנטיים, אנו עובדים עם תולעים ותאים שעברו קיבוע כימי. לכן, אי אפשר להמשיך לעקוב אחר אותן תולעים/תאים בזמנים שונים. לפיכך, אנו ממליצים לשלב מתודולוגיות שונות כדי לאמת את תפקוד המיטופגיה בתהליך פיזיולוגי מסוים. להלן, אנו מציגים נתונים חדשים המוכיחים כי VL-850 גורם למיטופגיה חזקה בתולעי C. elegans ובתאי Hep-3B. לכן, נתונים אלה תומכים עוד יותר בהשערה כי VL-850 מאריך את תוחלת החיים של C. elegans ומגן על C. elegans מפני נזק חמצוני באמצעות השראת מיטופגיה בריאה. השתמשנו בפרוטון יונופור קרבוניל ציאניד 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP), שהוא גורם מיטופגיה חזק24, כבקרה חיובית.

Protocol

הערה: לנוחיות הקוראים, חילקנו את הפרוטוקול לשני חלקים: האחד מתמקד בפרוטוקול למדידת מיטופגיה ב- C. elegans, והשני מתמקד בפרוטוקול למדידת מיטופגיה בתאי כבד. את רשימת החומרים ניתן למצוא בטבלת החומרים המצורפת.

1. פרוטוקול C. elegans

  1. הכנת לוחות גידול נמטודות (NGM) ומלאי חיידקי Escherichia coli OP50
    הערה: כנקודת הבהרה, בעוד שעקבנו אחר פרוטוקולים סטנדרטיים להכנת לוחות NGM ומלאי חיידקי OP5025,26, אנו מכירים בכך שייתכנו שינויים בפרוטוקולים אלה בין מעבדות שונות. לכן, כללנו את הפרוטוקולים המלאים כדי להבטיח שכפול מדויק של הניסוי.
    1. צור חיץ אשלגן פוספט של 1 M, pH 6, על ידי הוספת ~ 150 מ"ל של 1 M K 2 HPO 4 עד 500 מ"ל של 1 M KH2PO4 פתרון עד שתגיע ל- pH6. עקרו את המאגר על ידי העברתו דרך מסנן/מערכת אחסון ואקום 0.22 מיקרומטר.
    2. מייצרים 0.1 מ' סידן כלורי (CaCl 2) ומגנזיום גופרתי (MgSO4), ומחטאים אותם עם מסנן מזרקים0.2 מיקרומטר.
    3. הכינו 5 מ"ג/מ"ל כולסטרול באתנול מוחלט.
      הערה: מכיוון שהכולסטרול מוכן באתנול, אל תסנן אותו.
    4. הכינו NGM-אגר על ידי המסת 1.5 גרם נתרן כלורי (NaCl), 1.25 גרם פפטון ו-8.5 גרם אגר ב-500 מ"ל מים מזוקקים פעמיים (DDW). Autoclave ולתת לו להתקרר ~ 55 ° C.
    5. בתנאים סטריליים, יש להוסיף 12.5 מ"ל של חיץ אשלגן פוספט (pH 6), 0.5 מ"ל של 0.1 M CaCl2, 0.5 מ"ל של 0.1 M MgSO4, ו-1 מ"ל של 5 מ"ג/מ"ל כולסטרול. מערבבים היטב לאחר כל תוספת.
    6. הוסף 4 מ"ל של NGM-אגר מומס לכל צלחת 35 מ"מ. השאירו את הכלים למשך הלילה כדי להתמצק בטמפרטורת החדר (RT, ~ 21 ° C).
    7. כדי להכין צלחות אגר Luria-Bertani (LB), להמיס 5 גרם של NaCl, 5 גרם של טריפטון, 2.5 גרם של תמצית שמרים, ו 7.5 גרם של אגר ב 400 מ"ל של מים מזוקקים, deionized (DDW), להתאים את ה- pH של הפתרון ל 7.0, להביא את נפח עד 500 מ"ל עם DDW, autoclave. לאחר שהתמיסה התקררה ל -55 מעלות צלזיוס, שפכו 25 מ"ל מהתערובת לכל צלחת פטרי 90 מ"מ, ואפשרו לצלחות להתייבש במשך יומיים בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, פזרו את חיידקי OP50 על צלחות LB המיובשות ממלאי הגליצרול, ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך הלילה כדי להשיג מושבות בודדות.
    8. הכינו 2x טריפטון שמרים (YT) על ידי המסת 8 גרם טריפטון, 5 גרם תמצית שמרים, ו 2.5 גרם נתרן כלורי (NaCl) ב 0.5 ליטר של DDW. התאם את ה- pH ל- 7, ו- autoclave.
    9. לאחר הקירור, יש לחסן מושבת חיידקים מסוג OP50 מצלחת LB המפוספסת הטרייה ל-50 מ"ל של 2x YT בינוני בצלוחית Erlenmeyer בנפח 250 מ"ל. יש לנער ב-37°C וב-250 סל"ד לצפיפות אופטית (OD600) של כ-0.6.
  2. הכנת הרכב ולוחיות הניסוי
    1. הוסף 100 μL של חיידקי OP50 למרכז כל צלחת NGM-אגר 35 מ"מ. יבש לילה ב RT (טמפרטורת החדר, 21 °C).
    2. הכן 0.5 M VL-850 ב-DMSO, ודלל ל-10 mM VL-850 באמצעות מאגר M9 (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na2HPO 4, 86 mM NaCl,pH 7 ו-1 mM MgSO 4)26. אשר כי ה- pH הוא 7.0 (אם לא, טיטראט עם 0.1 M HCl), ולעקר את התמיסה עם מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. הכן את הרכב כמתואר לעיל, אך ללא התרופה (במקרה זה, VL-850). הפוך FCCP של 50 mM ב- DMSO, לדלל ל- 1 mM FCCP עם מאגר M9, ולעקר את התמיסה באמצעות מסנן מזרק של 0.22 מיקרומטר.
    3. הוסף 25 μL של רכב (בקרה שלילית), FCCP (בקרה חיובית; 5 μM), או VL-850 (טיפול ניסיוני; 62.5 μM) לצלחות NGM שנזרעו בנפרד על הדשא החיידקי.
    4. מכסים את הצלחות ברדיד אלומיניום, ומשאירים אותן להתייבש ב- RT (טמפרטורת החדר, 21 מעלות צלזיוס). השתמש בצלחות לאחר ~ 16 שעות.
  3. השגת בוגר צעיר מסונכרן C. elegans hermaphrodites
    1. צור 1 ליטר של חיץ M9 עם 22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na2HPO4 ו- 86 mM NaCl. לעקר על ידי autoclaving, ולתת לו להתקרר. לאחר הקירור, יש להוסיף 1 מ"ל של 1 mM MgSO4 (0.22 מיקרומטר שעבר סינון מעוקר).
    2. מערבבים 0.8 מ"ל של 2.5 N נתרן הידרוקסידי ו 1 מ"ל של תמיסה 5% של נתרן hypochlorite עם 2.2 מ"ל של DDW כדי ליצור 4 מ"ל תמיסה hypochlorite אלקליין (ריכוז סופי של 0.5 N עבור hydroxide נתרן ו 1.25% עבור hypochlorite נתרן).
    3. אספו את התולעים (הרמפרודיטים גרבידיים) לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל על ידי שטיפת לוחות NGM עם 1 מ"ל של חיץ M9 3x כדי להבטיח שכל האימהות נאספו לתוך הצינור.
    4. משקעים את התולעים על ידי צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 1 דקה, ולזרוק את supernatant עד נפח של 1 מ"ל נשאר.
    5. הוסף 1 מ"ל של תמיסת היפוכלוריט אלקליין, וערבב על ידי היפוך הצינור 5x. מערבלים בעדינות את הצינור במשך 3 דקות כדי לסייע בשחרור ביצים, ומתבוננים במצב התולעים תחת סטריאוסקופ מנתח.
    6. כאשר כ -50% מהתולעים נשברות, הוסף 5 מ"ל של חיץ M9 ומיד משקעים את הביצים על ידי צנטריפוגה במשך דקה אחת ב 500 × גרם.
    7. מוציאים את הסופרנאטנט בזהירות מבלי להפריע לכדור. הוסף 5 מ"ל של חיץ M9, וחזור על הליך הכביסה 2x.
    8. הסר את supernatant עד 2 מ"ל נשאר, וסובב את הצינור (360° סיבוב) ב 20 סל"ד במשך ~ 16 שעות (RT, 21 ° C) כדי לקבל זחלי L1 מסונכרנים. מצינור זה, קח טיפה של 5 μL על שקופית זכוכית, ספור את מספר הזחלים תחת סטריאוסקופ, חזור על שלב זה 3x, קח ממוצע של שלוש הספירות, והערך את מספר התולעים למיקרוליטר (μL). בהתבסס על חישובים אלה, הוסף ~ 200 זחלים לכל צלחת NGM שנזרעו עם חיידקי OP50.
    9. לגדל את הזחלים L1 ב 21 ° C במשך ~ 48 שעות עד שלב המבוגר הצעיר.
  4. טיפול תרופתי והליך מיקרוסקופיה
    1. שים 100 תולעים על כל אחד מלוחות הניסוי או הבקרה. ודא שהלוחות השליליים, החיוביים והניסיוניים מכילים את הרכב, 5 μM FCCP ו- 62.5 μM VL-850, בהתאמה. לדגור ב 21 ° C במשך 6 שעות.
    2. השתמש 1 מ"ל של חיץ M9 כדי לשטוף את התולעים מכל צלחת לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.7 מ"ל. סובב את הצינור לזמן קצר (~ 3 שניות) במיניצנטריפוגה. לאחר מכן, השליכו את הסופרנאטנט על ידי הוצאת חיץ M9 החוצה בעדינות מבלי להפריע לגלולת התולעת. חזור על שטיפה זו שלב 2x, ולאחר מכן להסיר בעדינות את supernatant מבלי להפריע גלולת התולעת.
    3. הוסף 200 μL של חיץ M9, המכיל 0.1% v/v Poloxamer 188, 0.1% v/v Pluronic F127, ו- 2 μL של מגיב ערכת הצביעה, לגלולת התולעת. תנו לתערובת להסתובב ב-20 סל"ד (סיבוב של 360°) למשך שעה אחת ב-RT (טמפרטורת החדר, 21°C). כדי להגן על הצבעים מפני אור, כסו את הצינורות ברדיד אלומיניום.
    4. סובבו את התולעים בעדינות, כמתואר בשלב 1.3.4. לאחר מכן, הסר את תמיסת הצביעה מבלי להפריע לגלולת התולעת. לאחר מכן, שטפו את התולעים כמתואר בשלב 1.3.2, והעבירו אותן לצלחת NGM-אגר זרעים המכילה את הטיפול המתאים - לדוגמה, תולעים שטופלו ב- FCCP מועברות לצלחת המכילה FCCP. כסו את הצלחות ברדיד אלומיניום מכיוון שמגיב הצביעה רגיש לאור.
      הערה: העברנו את התולעים לצלחות תרבית המכילות חיידקים ואת חומר הטיפול המתאים כדי למזער את רעשי הרקע עקב צבע עודף. לדוגמה, תולעים שטופלו ב-FCCP הועברו לצלחות בתוספת FCCP, וכן הלאה.
    5. לשטוף את התולעים מן הצלחות לתוך צינורות microcentrifuge טרי באמצעות 1 מ"ל של חיץ M9; לשטוף את התולעים באותו אופן 2x. לאחר מכן, לתקן את התולעים עם 1% פורמלין על קרח במשך 30 דקות, ולשטוף את התולעים עם 1 מ"ל של M9 חיץ 3x כדי להסיר שאריות פורמלין. לאחר השטיפה, סובבו את התולעים עד לכדורית, ושאפו לכמות מקסימלית של סופרנטנט, תוך שמירה על שלמות כדורית התולעת ב-10 מיקרוליטר של M9.
    6. להכנת 2.5% אגרוז, שוקלים 0.125 גרם אגרוז לתוך מבחנה מזכוכית בורוסיליקט 10 מ"ל, מוסיפים 5 מ"ל של חיץ M9 וממיסים את האגרוז על ידי חימום עדין של הצינור עם מבער בונזן. מעבירים את האגרוז המומס לאמבטיה יבשה בטמפרטורה של 75°C, ובעזרת קצה של 1 מ"ל, מניחים 100 μL של האגרוז המומס על זכוכית כיסוי של מיקרוסקופ Deckgläser (24 מ"מ x 60 מ"מ). מיד, לשים עוד שקופית בניצב על טיפת agarose, יצירת צורת צלב. המתן ~ 2 דקות, והפרד בעדינות את המגלשות על ידי דחיפה (עדינה) של זכוכית הכיסוי העליונה, ובכך משאיר את כרית האגרוז על מגלשת הכיסוי התחתונה.
      הערה: היזהר בעת חימום האגרוז בצינור, וודא שהצינור מוחזק הרחק מהגוף. חותכים את הקצה של 1 מ"ל קצה כדי למזער קרישה של agarose.
    7. מעבירים את התולעים על כרית האגרוז עם פיפטה מזכוכית פסטר (כלומר, כל הכמות בצינור, ~10 μL). הסר את הנוזל העודף עם פתיל עשוי מגבון מעבדה, ולאחר מכן לכסות את התולעים עם שקופית כיסוי קטנה יותר (24 מ"מ x 40 מ"מ). יש למרוח לק שקוף על שולי מגלשת הכיסוי הקטנה יותר כדי למנוע אידוי. שים את המגלשה בתיבה חשוכה כדי להגן עליה מפני אור.
    8. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לצלם את התולעים תוך 24 שעות באורכי הגל המתאימים (ראה להלן) באמצעות עדשת הגדלה פי 60.
      1. הניחו את השקופית על במת המיקרוסקופ.
      2. פתח את תוכנת ההדמיה ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על האזור האפור של התוכנה. רכישה פתוחה | Ti2 Full Pad | רכישת ND | LUTs על ידי לחיצה על האפשרויות על החלון המוקפץ שמופיע כתוצאה מהלחיצה הנכונה.
      3. תחת Ti2 Full Pad, בחר 60x.
      4. תחת רכישה, בחר Eyepiece DIA, והבא את התולעים למיקוד באמצעות ידית המיקרוסקופ למיקוד עדין. תחת רכישה, בחר דיסק מסתובב ובחר באפשרות 16 סיביות - ללא בינינג. עבור כל מסנן פלואורסצנטי, הגדר את זמן החשיפה ל- 500 אלפיות השנייה ו- 20 אלפיות השנייה עבור Brightfield. לאחר הגדרת פרמטרים אלה, בחר הפעל כעת והמתן ליצירת תמונת הפלט כקובץ ND2.
        הערה: זמן החשיפה צריך להיקבע באופן ניסיוני, מכיוון שלמערכי הדמיה שונים יש מאפיינים שונים. השתמש בטבלאות בדיקת מידע (LUTs) כדי לבחון את עוצמת הפלואורסצנטיות עבור כל אורך גל.
  5. ניתוח תמונות
    1. פתח את התמונות confocal (כאן, Nikon ND2 קבצים) ב ImageJ27 עם תוסף colocalization. כל קובץ ND מכיל מישורי תמונה שצולמו בשלושה אורכי גל (באמצעות המסננים DAPI, GFP/FITC [ירוק] ואדום טקסס [אדום]) ואור נראה. כדי לגשת לתמונות אלה, פתחו את קובץ ה-ND בשרת ImageJ ובחרו ' פצל תמונות ' בתיבת הדו-שיח. עבוד עם תמונות שדה בהיר (BF), ערוץ ירוק וערוץ אדום.
    2. צור כפילויות של תמונות אלה כדי לשמור על התמונה המקורית ללא נגיעה על ידי לחיצה על תמונה | שכפל או השתמש בקיצור המקשים Shift + D.
    3. כדי להקטין את הרקע, צור עותק נוסף של התמונה, כפי שהוזכר לעיל. הפחיתו את הרקע ברדיוס גלגול של 100, ובחרו באפשרות 'צור רקע (אל תחסר') ליצירת תמונה עם הרקע של התמונה הנתונה. לאחר מכן, עבור אל תהליך | מחשבון תמונה, והחסר את התמונה המשוכפלת הראשונה מהתמונה המשוכפלת השנייה. השתמש בתמונות המתקבלות לניתוח לוקליזציה.
    4. כדי להשתמש בתוסף colocalization, המר את תמונות הערוץ הירוק והערוץ האדום ל - 8 סיביות. לשם כך, לחץ על תמונה | סוג | 8 סיביות.
    5. לחץ על תוספים | קולוקליזציה. כדי למדוד את הקולוקליזציה של אותות מיטוכונדריה וליזוזום באמצעות תוסף קולוקליזציה (ראה לעיל), השתמש בפרמטרים הבאים: יחס = 75%, ערוץ אדום סף = 80.0, ערוץ ירוק סף = 50.0. הפלט הוא תמונה בינארית של 8 סיביות הכוללת פונקטה מותאמת לשפות אחרות ושילוב של שלוש תמונות של 8 סיביות (ירוק, אדום ותמונה עם לוקליזציה) בתמונת RGB.
    6. התמקדו בפונקטה בשריר הגוף-קיר של התולעים על ידי בחירה ידנית של אזור זה ויצירת מסכה על ידי לחיצה על עריכה | בחירה | צור מסיכה, שבוחרת את אזור העניין (איור 2A, B). הסר באופן סלקטיבי ישויות מוכתמות אחרות (למשל, שרירי הלוע) כדי לנתח את אזור שרירי גוף הגוף.
    7. כדי לבחור את החלקיקים באזור העניין (ROI), בחר את תמונות 8 הסיביות והמסיכות המותאמות לשפות אחרות באמצעות מחשבון התמונות. לאחר מכן, השתמשו בפעולה AND (איור 3A) כדי לבחור את הפונקטה בהחזר ההשקעה. זה יוצר תמונה עם פונקטה בהחזר ההשקעה (איור 3B).
    8. כדי לנתח את האזור של המיטוכונדריה והליזוזומים, בחר נתח | לנתח חלקיקים, ולמדוד את סיכום של puncta בין 0.1625 מיקרומטר 2 ו 4 מיקרומטר2.

2. פרוטוקול תאי סרטן Hep-3B

  1. הכנת פתרון מלאי התרופות
    1. הכן 100 mM VL-850 ב- DMSO. לדלל אותו ל 5 mM עם חיץ 0.5 M HEPES, pH 7.3, ולעקר את התמיסה באמצעות מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן, להכין את הרכב כפי שתואר קודם, אבל ללא התרופה (במקרה זה, VL-850).
  2. גידול תאי Hep-3B לצורך ניסוי, טיפול תרופתי והליך מיקרוסקופיה
    1. גידול תאי Hep-3B בצלחות תרבית רקמה בקוטר 10 ס"מ המכילות את מדיום הנשר המעובד (DMEM) של דולבקו בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי מומת חום (FBS), 2% L-גלוטמין ו-1% טטרציקלין (להלן DMEM מלא). לדגור על התאים ב 37 ° C ו 5% CO2.
    2. בחר צלחת של תאי Hep-3B המציגים מפגש תאים של 70%-80% (שלב גידול לוגריתמי), הסר את המדיום ושטוף את הצלחת עם 5 מ"ל של מלח חוצץ פוספט שחומם מראש (PBS). הסר את PBS, ודגר על התאים עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין / 0.02% EDTA מחומם מראש במשך ~ 3 דקות ב 37 ° C; התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ תרבית רקמה (10x). עצור את עיכול טריפסין כאשר התאים הופכים עגולים ולהתחיל להתנתק מהצלחת על ידי הוספת 5 מ"ל של DMEM מלא. צנטריפוגו את התאים ב 1,000 × גרם במשך 5 דקות, להסיר את supernatant, ולהשהות מחדש את התאים ב 5 מ"ל של DMEM מלא.
    3. לקבוע את ריכוז התא. מערבבים 50 μL של תרחיף התא עם 50 μL של כחול טריפאן. ספור את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי או באמצעות המוציטומטר פי 5, וקח ממוצע של ספירות אלה כדי להבטיח את דיוק הספירות.
    4. זרע 42,000 תאי Hep3G בכל 8-באר μ-slide ב 400 μL של DMEM מלא (כמתואר לעיל). לדגור על התאים במשך 24 שעות ב 37 ° C ו 5% CO2.
    5. לאחר 24 שעות במפגש ~80%-85%, הסר 250 μL של מדיום מכל אחת מהבארות, והוסף 50 μL של מדיום עם הטיפול או הרכב המתאימים. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, טפל בתאים עם 100 מיקרומטר VL-850, 5 מיקרומטר FCCP, ורכב כבקרה.
    6. לאחר הדגירה של 6 שעות עם התרכובות, מוסיפים 50 מיקרוליטר של מדיום לכל באר המכילה את מגיב הצביעה (0.5 מיקרוליטר צבע עבור 250 מיקרוליטר בכל באר). לדגור על התאים עם הצבע במשך 30 דקות ב 37 ° C ו 5% CO2.
      הערה: מכיוון שמגיב הצביעה רגיש לאור, מזער את החשיפה לאור על ידי כיסוי הדגימות ברדיד אלומיניום ועבודה בסביבה של אור עמום (במידת האפשר).
    7. באמצעות פיפטה 200 μL, להסיר בעדינות את כל המדיום (250 μL) מכל באר, ולאחר מכן לשטוף את התאים עם 200 μL של PBS שחומם מראש.
    8. תקן את התאים עם 200 μL של תמיסת קיבוע המכילה 4% פורמלדהיד ו 2.5% גלוטראלדהיד מוכן PBS במשך 15 דקות ב RT.
    9. דקרו את התמיסה המקבעת, ושטפו לזמן קצר עם 200 מיקרוליטר של PBS.
    10. הוסף 200 μL של PBS, שמור על התאים מכוסים ומוגנים מפני אור ב 4 ° C, ותמונה בתוך 24 שעות.
      הערה: השתמשנו במיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב בארבעה ערוצים, כולל DIC, TRITC, FITC ו- DAPI, כמו בשלב 1.4.8. צילמנו ~300 תאים לכל טיפול.
  3. ניתוח תמונות
    1. בצע את שלבים 1.5.1-1.5.5. כדי להשיג את החזר ההשקעה של התאים, צור תמונה המדגישה את אזור התאים. לשם כך, בחרו תמונת נקודות מותאמות לשפות אחרות (RGB) (איור 4A). כדי לבחור את כל אזור התא, בחר תהליך | בינארי | צרו מסיכה לקבלת תמונה בינארית (איור 4B). כדי לנתח את אזור התא, בחר נתח | נתח חלקיקים ומדוד את כל החלקיקים בתמונה מ- 0 עד אינסוף, שהיא הגדרת ברירת המחדל לניתוח חלקיקים.
    2. כדי לנתח את האזור של המיטוכונדריה והליזוזומים שעברו לוקליזציה, בחרו תמונה בת 8 סיביות שעברו לוקליזציה, המירו אותה לבינארית על-ידי בחירה באפשרות בחר תהליך | בינארי | הפוך לקובץ בינארי, בחר נתח | לנתח חלקיקים, ולמדוד את הסיכום של puncta בין 0.1625 מיקרומטר 2 ו 4 מיקרומטר2. כדי למדוד את הפונקטה המקומית, חלקו את שטח המיטוכונדריה והליזוזומים המשותפים בשטח התא הכולל.

תוצאות

השראת תגובת מיטופגיה חזקה הן בתולעי C. elegans והן בתאי Hep-3B עם VL-850
VL-850 מגן על תולעי C. elegans ועל קרטינוציטים אנושיים (תאי HaCaT) מפני עקה חמצונית23. כדי להמשיך ולחקור את מנגנון הפעולה שלו, בחנו אם VL-850 גורם למיטופגיה ב-C. elegans ובתאים אנושיים אחרים. כדי לבדוק זאת, חשפ?...

Discussion

מסלולי מיטופגיה מרובים מערבים חלבונים וביומולקולות שונות (למשל, קרדיוליפין29). עם זאת, נקודת הקצה של מסלולים אלה דומה - פירוק מיטוכונדריה על ידי אנזימים ליזוזומליים12,13. ואכן, מספר שיטות משתמשות בנקודת קצה זו כדי לכמת מיטופגיה. עם זאת, שיטות מסוימ?...

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgements

אנו מודים לחברי מעבדת גרוס על הקריאה הביקורתית של כתב היד ועל הערותיהם ועצותיהם. אנו מודים למרכז Caenorhabditis Genetics Center (CGC), הממומן על ידי משרד הבריאות הלאומי לתוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440), על אספקת חלק מהזנים. מחקר זה נתמך על ידי מענק מחברת ויטלונגה בע"מ והקרן הלאומית למדע (מענק מס' 989/19). האיור המופשט הגרפי (איור 1) נוצר עם BioRender.com.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent or resource
Analytical balanceMettler-Toledo
Bacto AgarBD-Difco214010
Bacto PeptoneBD-Difco211677
Bacto TryptoneBD-Difco211705
Bacto Yeast extractBD-Difco212750
Calcium chlorideSigmaC1016
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)SigmaC2920
Chemicals
CholestrolThermo FisherC/5360/48
DMEM high glucoseBiological Industries01-055-1A
Double distilled water (DDW)
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)Biological Industries02-023-1A
FBS heat inactivatedInvitrogenM7514
Gluteradehyde (25%)SigmaG5882
HEPES Buffer 1 MBiological Industries03-025-1B
L-gluatamineBiological Industries03-020-1B
Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter ReagentAbcamab139487
Magnesium SulfateSigmaM7506
Nonidet P 40Sigma74385
Paraformalydehyde (16%)Electron Microscopy Sciences15720
Poloxamer 188 SolutionSigmaP5556
Potassium dihydrogen phosphateMillipore1.04873.1000
Potassium phosphate dibasicSigmaP3786
SeaKem LE AgaroseLonza50004
Sodium ChlorideBio-Lab1903059100
Sodium HydroxideGadot1310732
Sodium phosphate dibasic dodecahydrateSigma4273
Tetracycline hydrochlorideSigma87128-25G
Trypsin-EDTABiological Industries03-052-1A
VL-850: 1,8-diaminooxy-octanePatented
Glass/Plastic Disposables
0.22 μm syringe filterMillex GVSLGV033RS
1.7 mL Micro Centrifuge TubesLifegeneLMCT1.7B-500
10 cm Petri platesCorning430167
1,000 mL Erlenmeyer FlaskIsoLab, Germany
15 mL Sterile Polypropylene tubeLifegeneLTB15-500
35 mm Petri dishesBar NaorBN9015810
500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μmLifegeneLG-FPE205500S
50 mL Sterile Polypropylene tubeLifegeneLTB50-500
Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mmMarienfeld101152
Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glassPyrex99445-13
iBiDi 8 well μ-slidesiBiDi80826
Microscope cover glass 24 x 40 mmBar NaorBN1052421ECALN
Platinum iridium 0.25 mM wireWorld Precision InstrumentsPT1002
Instruments
Cell counter CellDrop BFDeNovixCellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400BiosanBS-010201-AAA
Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements softwareNikonCSU-W1
Olympus SZ61 stereo microscopeOlympusSZ61
pH meterMettler-ToledoMT30019032
Revolver Adjustable Lab RotatorLabnetH5600

References

  1. Westermann, B. Molecular machinery of mitochondrial fusion and fission. Journal of Biological Chemistry. 283 (20), 13501-13505 (2008).
  2. Piel, R. B., Dailey, H. A., Medlock, A. E. The mitochondrial heme metabolon: Insights into the complex(ity) of heme synthesis and distribution. Molecular Genetics and Metabolism. 128 (3), 198-203 (2019).
  3. Houten, S. M., Violante, S., Ventura, F. V., Wanders, R. J. A. The biochemistry and physiology of mitochondrial fatty acid β-oxidation and its genetic disorders. Annual Review of Physiology. 78, 23-44 (2016).
  4. Jung, S., et al. Mitofusin 2, a mitochondria-ER tethering protein, facilitates osteoclastogenesis by regulating the calcium-calcineurin-NFATc1 axis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 516 (1), 202-208 (2019).
  5. Carraway, M. S., Suliman, H. B., Madden, M. C., Piantadosi, C. A., Ghio, A. J. Metabolic capacity regulates iron homeostasis in endothelial cells. Free Radical Biology and Medicine. 41 (11), 1662-1669 (2006).
  6. Armstrong, J. S. Mitochondrial medicine: Pharmacological targeting of mitochondria in disease. British Journal of Pharmacology. 151 (8), 1154-1165 (2007).
  7. Hamanaka, R. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species regulate cellular signaling and dictate biological outcomes. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 505-513 (2010).
  8. Palikaras, K., Tavernarakis, N. Mitochondrial homeostasis: The interplay between mitophagy and mitochondrial biogenesis. Experimental Gerontology. 56, 182-188 (2014).
  9. Ashrafi, G., Schwarz, T. L. The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria. Cell Death and Differentiation. 20, 31-42 (2013).
  10. Bhujabal, Z., et al. FKBP8 recruits LC3A to mediate Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 18 (6), 947-961 (2017).
  11. Martinez-Vicente, M. Neuronal mitophagy in neurodegenerative diseases. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 64 (2017).
  12. Zimmermann, M., Reichert, A. S. How to get rid of mitochondria: Crosstalk and regulation of multiple mitophagy pathways. Biological Chemistry. 399 (1), 29-45 (2017).
  13. Almacellas, E., et al. Lysosomal degradation ensures accurate chromosomal segregation to prevent chromosomal instability. Autophagy. 17 (3), 796-813 (2021).
  14. Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy. EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).
  15. Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery. Chemistry & Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).
  16. Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy. Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).
  17. Sun, N., et al. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12, 1576-1587 (2017).
  18. Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans. Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).
  19. Yim, W. W. -. Y., Mizushima, N. Lysosome biology in autophagy. Cell Discovery. 6, 6 (2020).
  20. Katayama, H., et al. Visualizing and modulating mitophagy for therapeutic studies of neurodegeneration. Cell. 181 (5), 1176-1187 (2020).
  21. Shpilka, T., et al. UPR(mt) scales mitochondrial network expansion with protein synthesis via mitochondrial import in Caenorhabditis elegans. Nature Communications. 12, 479 (2021).
  22. Liao, Z., et al. The degradation of TMEM166 by autophagy promotes AMPK activation to protect SH-SY5Y cells exposed to MPP(). Cells. 11 (17), 2706 (2022).
  23. Srivastava, V., et al. Distinct designer diamines promote mitophagy, and thereby enhance healthspan in C. elegans and protect human cells against oxidative damage. Autophagy. 19 (2), 474-504 (2022).
  24. Georgakopoulos, N. D., Wells, G., Campanella, M. The pharmacological regulation of cellular mitophagy. Nature Chemical Biology. 13 (2), 136-146 (2017).
  25. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  26. Wood, W. B. . The Nematode Caenorhabditis Elegans. , (1988).
  27. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  28. Knowles, B. B., Howe, C. C., Aden, D. P. Human hepatocellular carcinoma cell lines secrete the major plasma proteins and hepatitis B surface antigen. Science. 209 (4455), 497-499 (1980).
  29. Antón, Z., et al. Human Atg8-cardiolipin interactions in mitophagy: Specific properties of LC3B, GABARAPL2 and GABARAP. Autophagy. 12 (12), 2386-2403 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

195Caenorhabditis elegansHep 3B

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved