Détection de la mitophagie chez Caenorhabditis elegans et des cellules de mammifères à l’aide de colorants spécifiques aux organites

Résumé

L’exploration de la mitophagie par microscopie électronique, capteurs génétiques et immunofluorescence nécessite un équipement coûteux, du personnel qualifié et un investissement en temps important. Ici, nous démontrons l’efficacité d’un kit de colorant de fluorescence commercial pour quantifier le processus de mitophagie à la fois chez Caenorhabditis elegans et dans une lignée cellulaire de cancer du foie.

Résumé

Les mitochondries sont essentielles à diverses fonctions biologiques, notamment la production d’énergie, le métabolisme des lipides, l’homéostasie du calcium, la biosynthèse de l’hème, la mort cellulaire régulée et la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Les ROS sont vitales pour les processus biologiques clés. Cependant, lorsqu’ils ne sont pas contrôlés, ils peuvent entraîner des lésions oxydatives, y compris des dommages mitochondriaux. Les mitochondries endommagées libèrent plus de ROS, intensifiant ainsi les lésions cellulaires et l’état de la maladie. Un processus homéostatique appelé autophagie mitochondriale (mitophagie) élimine sélectivement les mitochondries endommagées, qui sont ensuite remplacées par de nouvelles. Il existe plusieurs voies de mitophagie, le critère d’évaluation commun étant la dégradation des mitochondries endommagées dans les lysosomes.

Plusieurs méthodologies, y compris les capteurs génétiques, l’immunofluorescence des anticorps et la microscopie électronique, utilisent ce paramètre pour quantifier la mitophagie. Chaque méthode d’examen de la mitophagie a ses avantages, tels que le ciblage tissulaire/cellulaire spécifique (avec des capteurs génétiques) et un grand détail (avec la microscopie électronique). Cependant, ces méthodes nécessitent souvent des ressources coûteuses, du personnel formé et un long temps de préparation avant l’expérience réelle, par exemple pour créer des animaux transgéniques. Ici, nous présentons une alternative rentable pour mesurer la mitophagie en utilisant des colorants fluorescents disponibles dans le commerce ciblant les mitochondries et les lysosomes. Cette méthode mesure efficacement la mitophagie chez le nématode Caenorhabditis elegans et les cellules hépatiques humaines, ce qui indique son efficacité potentielle dans d’autres systèmes modèles.

Introduction

Les mitochondries sont essentielles pour tous les animaux aérobies, y compris les humains. Ils convertissent l’énergie chimique des biomolécules en adénosine triphosphate (ATP) via la phosphorylation oxydative¹, synthétisent l’hème², dégradent les acides gras par oxydation^{β 3}, régulent l’homéostasie du calcium⁴ et du fer⁵ , contrôlent la mort cellulaire par apoptose⁶ et génèrent des espèces réactives de l’oxygène (ROS), qui jouent un rôle vital dans l’homéostasie redox⁷. Deux processus compléme....

Protocole

NOTE: Pour la commodité des lecteurs, nous avons divisé le protocole en deux parties: l’une se concentre sur le protocole de mesure de la mitophagie chez C. elegans, et l’autre se concentre sur le protocole de mesure de la mitophagie dans les cellules hépatiques. La liste des matériaux se trouve dans le tableau des matériaux fourni.

1. Le protocole C. elegans

1. Préparation des plaques de milieu de croissance des nématodes (NGM) et du stock bactérien OP50 d’Escherichia coli
   NOTE: À titre de clarification, bien que nous ayons suivi les protocoles standard pour la préparat....

Discussion

Les voies de mitophagie multiples impliquent diverses protéines et biomolécules (par exemple, cardiolipine²⁹). Cependant, le point final de ces voies est similaire - la dégradation des mitochondries par les enzymes lysosomales^12,13. En effet, plusieurs méthodes utilisent ce paramètre pour quantifier la mitophagie. Cependant, certaines méthodes, telles que la microscopie électronique, nécessitent l’accès à un équipement coûteu.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent or resource
Analytical balance	Mettler-Toledo
Bacto Agar	BD-Difco	214010
Bacto Peptone	BD-Difco	211677
Bacto Tryptone	BD-Difco	211705
Bacto Yeast extract	BD-Difco	212750
Calcium chloride	Sigma	C1016
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)	Sigma	C2920
Chemicals
Cholestrol	Thermo Fisher	C/5360/48
DMEM high glucose	Biological Industries	01-055-1A
Double distilled water (DDW)
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biological Industries	02-023-1A
FBS heat inactivated	Invitrogen	M7514
Gluteradehyde (25%)	Sigma	G5882
HEPES Buffer 1 M	Biological Industries	03-025-1B
L-gluatamine	Biological Industries	03-020-1B
Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent	Abcam	ab139487
Magnesium Sulfate	Sigma	M7506
Nonidet P 40	Sigma	74385
Paraformalydehyde (16%)	Electron Microscopy Sciences	15720
Poloxamer 188 Solution	Sigma	P5556
Potassium dihydrogen phosphate	Millipore	1.04873.1000
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P3786
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
Sodium Chloride	Bio-Lab	1903059100
Sodium Hydroxide	Gadot	1310732
Sodium phosphate dibasic dodecahydrate	Sigma	4273
Tetracycline hydrochloride	Sigma	87128-25G
Trypsin-EDTA	Biological Industries	03-052-1A
VL-850: 1,8-diaminooxy-octane	Patented
Glass/Plastic Disposables
0.22 μm syringe filter	Millex GV	SLGV033RS
1.7 mL Micro Centrifuge Tubes	Lifegene	LMCT1.7B-500
10 cm Petri plates	Corning	430167
1,000 mL Erlenmeyer Flask	IsoLab, Germany
15 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB15-500
35 mm Petri dishes	Bar Naor	BN9015810
500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm	Lifegene	LG-FPE205500S
50 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB50-500
Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm	Marienfeld	101152
Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass	Pyrex	99445-13
iBiDi 8 well μ-slides	iBiDi	80826
Microscope cover glass 24 x 40 mm	Bar Naor	BN1052421ECALN
Platinum iridium 0.25 mM wire	World Precision Instruments	PT1002
Instruments
Cell counter CellDrop BF	DeNovix	CellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400	Biosan	BS-010201-AAA
Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software	Nikon	CSU-W1
Olympus SZ61 stereo microscope	Olympus	SZ61
pH meter	Mettler-Toledo	MT30019032
Revolver Adjustable Lab Rotator	Labnet	H5600