Rilevazione della mitofagia in Caenorhabditis elegans e cellule di mammifero utilizzando coloranti organelli-specifici

Riepilogo

Esplorare la mitofagia attraverso la microscopia elettronica, i sensori genetici e l'immunofluorescenza richiede attrezzature costose, personale qualificato e un investimento di tempo significativo. Qui, dimostriamo l'efficacia di un kit di coloranti a fluorescenza commerciale nel quantificare il processo mitofagico sia in Caenorhabditis elegans che in una linea cellulare di cancro al fegato.

Abstract

I mitocondri sono essenziali per varie funzioni biologiche, tra cui la produzione di energia, il metabolismo lipidico, l'omeostasi del calcio, la biosintesi dell'eme, la morte cellulare regolata e la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS). I ROS sono vitali per i processi biologici chiave. Tuttavia, se incontrollati, possono portare a lesioni ossidative, incluso il danno mitocondriale. I mitocondri danneggiati rilasciano più ROS, intensificando così il danno cellulare e lo stato della malattia. Un processo omeostatico chiamato autofagia mitocondriale (mitofagia) rimuove selettivamente i mitocondri danneggiati, che vengono poi sostituiti da nuovi. Esistono molteplici percorsi mitofagici, con l'endpoint comune che è la rottura dei mitocondri danneggiati nei lisosomi.

Diverse metodologie, tra cui sensori genetici, immunofluorescenza anticorpale e microscopia elettronica, utilizzano questo endpoint per quantificare la mitofagia. Ogni metodo per esaminare la mitofagia ha i suoi vantaggi, come il targeting specifico di tessuti / cellule (con sensori genetici) e grande dettaglio (con microscopia elettronica). Tuttavia, questi metodi spesso richiedono risorse costose, personale addestrato e un lungo tempo di preparazione prima dell'esperimento vero e proprio, ad esempio per la creazione di animali transgenici. Qui, presentiamo un'alternativa economica per misurare la mitofagia utilizzando coloranti fluorescenti disponibili in commercio mirati ai mitocondri e ai lisosomi. Questo metodo misura efficacemente la mitofagia nel nematode Caenorhabditis elegans e nelle cellule epatiche umane, il che indica la sua potenziale efficienza in altri sistemi modello.

Introduzione

I mitocondri sono essenziali per tutti gli animali aerobici, compresi gli esseri umani. Convertono l'energia chimica delle biomolecole in adenosina trifosfato (ATP) tramite fosforilazione ossidativa¹, sintetizzano l'eme², degradano gli acidi grassi attraverso l'ossidazione β³, regolano l'omeostasi del calcio⁴ e del ferro⁵ , controllano la morte cellulare mediante apoptosi⁶ e generano specie reattive dell'ossigeno (ROS), che svolgono un ruolo vitale nell'omeostasi redox⁷. Due processi complement....

Protocollo

NOTA: Per comodità dei lettori, abbiamo diviso il protocollo in due parti: una si concentra sul protocollo per misurare la mitofagia in C. elegans e l'altra si concentra sul protocollo per misurare la mitofagia nelle cellule del fegato. L'elenco dei materiali può essere trovato nella tabella dei materiali fornita.

1. Il protocollo di C. elegans

1. Preparazione delle piastre del terreno di crescita dei nematodi (NGM) e dello stock batterico di Escherichia coli OP50
   NOTA: Come punto di chiarimento, mentre abbiamo seguito i protocolli standard per la preparazione delle pias....

Discussione

Molteplici vie mitofagiche coinvolgono varie proteine e biomolecole (ad esempio, cardiolipina²⁹). Tuttavia, l'endpoint di queste vie è simile: la degradazione dei mitocondri da parte degli enzimi lisosomiali^12,13. In effetti, diversi metodi utilizzano questo endpoint per quantificare la mitofagia. Tuttavia, alcuni metodi, come la microscopia elettronica, richiedono l'accesso ad attrezzature costose, esperti addestrati e un tempo di prepar.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent or resource
Analytical balance	Mettler-Toledo
Bacto Agar	BD-Difco	214010
Bacto Peptone	BD-Difco	211677
Bacto Tryptone	BD-Difco	211705
Bacto Yeast extract	BD-Difco	212750
Calcium chloride	Sigma	C1016
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)	Sigma	C2920
Chemicals
Cholestrol	Thermo Fisher	C/5360/48
DMEM high glucose	Biological Industries	01-055-1A
Double distilled water (DDW)
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biological Industries	02-023-1A
FBS heat inactivated	Invitrogen	M7514
Gluteradehyde (25%)	Sigma	G5882
HEPES Buffer 1 M	Biological Industries	03-025-1B
L-gluatamine	Biological Industries	03-020-1B
Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent	Abcam	ab139487
Magnesium Sulfate	Sigma	M7506
Nonidet P 40	Sigma	74385
Paraformalydehyde (16%)	Electron Microscopy Sciences	15720
Poloxamer 188 Solution	Sigma	P5556
Potassium dihydrogen phosphate	Millipore	1.04873.1000
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P3786
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
Sodium Chloride	Bio-Lab	1903059100
Sodium Hydroxide	Gadot	1310732
Sodium phosphate dibasic dodecahydrate	Sigma	4273
Tetracycline hydrochloride	Sigma	87128-25G
Trypsin-EDTA	Biological Industries	03-052-1A
VL-850: 1,8-diaminooxy-octane	Patented
Glass/Plastic Disposables
0.22 μm syringe filter	Millex GV	SLGV033RS
1.7 mL Micro Centrifuge Tubes	Lifegene	LMCT1.7B-500
10 cm Petri plates	Corning	430167
1,000 mL Erlenmeyer Flask	IsoLab, Germany
15 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB15-500
35 mm Petri dishes	Bar Naor	BN9015810
500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm	Lifegene	LG-FPE205500S
50 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB50-500
Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm	Marienfeld	101152
Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass	Pyrex	99445-13
iBiDi 8 well μ-slides	iBiDi	80826
Microscope cover glass 24 x 40 mm	Bar Naor	BN1052421ECALN
Platinum iridium 0.25 mM wire	World Precision Instruments	PT1002
Instruments
Cell counter CellDrop BF	DeNovix	CellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400	Biosan	BS-010201-AAA
Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software	Nikon	CSU-W1
Olympus SZ61 stereo microscope	Olympus	SZ61
pH meter	Mettler-Toledo	MT30019032
Revolver Adjustable Lab Rotator	Labnet	H5600