オルガネラ特異的色素を用いた カエノラブディティス・エレガンス および哺乳類細胞におけるマイトファジーの検出

要約

電子顕微鏡、遺伝子センサー、免疫蛍光法によるマイトファジーの探索には、高価な機器、熟練した人員、および多大な時間投資が必要です。ここでは、 カエノラブディティスエレガンス と肝がん細胞株の両方におけるマイトファジープロセスの定量化における市販の蛍光色素キットの有効性を実証します。

要約

ミトコンドリアは、エネルギー生産、脂質代謝、カルシウム恒常性、ヘム生合成、細胞死の制御、活性酸素種(ROS)の生成など、さまざまな生物学的機能に不可欠です。ROSは重要な生物学的プロセスに不可欠です。ただし、制御されていない場合、ミトコンドリアの損傷を含む酸化的損傷を引き起こす可能性があります。損傷したミトコンドリアはより多くのROSを放出し、それによって細胞傷害および疾患状態を強める。ミトコンドリアオートファジー(マイトファジー)と呼ばれる恒常性維持プロセスは、損傷したミトコンドリアを選択的に除去し、その後、新しいミトコンドリアに置き換えられます。複数のマイトファジー経路があり、共通のエンドポイントはリソソームの損傷したミトコンドリアの分解です。

遺伝子センサー、抗体免疫蛍光法、電子顕微鏡法などのいくつかの方法論では、このエンドポイントを使用してマイトファジーを定量化します。マイトファジーを調べるための各方法には、特定の組織/細胞の標的化(遺伝子センサーを使用)や非常に詳細(電子顕微鏡を使用)などの利点があります。しかしながら、これらの方法は、しばしば高価な資源、訓練を受けた人員、およびトランスジェニック動物の作成などの実際の実験の前に長い準備時間を必要とする。ここでは、ミトコンドリアとリソソームを標的とする市販の蛍光色素を使用してマイトファジーを測定するための費用対効果の高い代替手段を紹介します。この方法は、線虫カ エノラブディティスエレガンス とヒト肝細胞のマイトファジーを効果的に測定し、他のモデルシステムでの潜在的な効率を示しています。

概要

ミトコンドリアは、人間を含むすべての好気性動物にとって不可欠です。生体分子の化学エネルギーを酸化的リン酸化¹によるアデノシン三リン酸(ATP)への変換、ヘム²の合成、β酸化³による脂肪酸の分解、カルシウム⁴と鉄⁵の恒常性を調節し、アポトーシス⁶による細胞死の制御、酸化還元恒常性に重要な役割を果たす活性酸素種(ROS)の生成7.新しいミトコンドリア成分の合成(生合成)と、ミトコンドリアのオートファジー(すなわちマイトファ^{ジー)による}損傷成分の選択的除去という2つの相補的で反対のプロセスがミトコンドリアの完全性と適切な機能を維持します8。

いくつかのマイトファジー経路は、PINK1 /パーキンなどの酵素、およびFUNDC1、FKBP8、およびBNIP/NIX ^9,10などの受容体によって媒介されます。特に、ミトコンドリア成分の選択的分解は、オートファゴソーム機構とは無関....

プロトコル

注:読者の便宜のために、プロトコルを2つの部分に分けました:1つは C.エレガンスのマイトファジーを測定するためのプロトコルに焦点を当て、もう1つは肝細胞のマイトファジーを測定するためのプロトコルに焦点を当てています。材料のリストは、提供されている 材料の表 にあります。

1. C.エレガンス プロトコル

1. 線虫増殖培地(NGM)プレートおよび 大腸菌 OP50細菌ストックの調製
   注:明確にするために、NGMプレートとOP50細菌ストックの調製のための標準プロトコルに従いましたが^25,26、^異なるラボ間でこれらのプロトコルにばらつきがある可能性があることを認識しています。したがって、実験の正確な複製を保証するための完全なプロトコルが含まれています。
   1. pH 6に達するまで、1 M K 2 HPO 4 500 mL の 1 M K₂HPO₄ に 500 mL の 1 M リン酸カリウムバッファー pH 6 を加えます。バッファーを0.22 μmの真空フィルター/保存システムに通して滅菌します。
   2. 0.....

ディスカッション

複数のマイトファジー経路には、さまざまなタンパク質や生体分子(カルジオリピン²⁹など)が含まれます。しかし、これらの経路のエンドポイントは類似しており、リソソーム酵素によるミトコンドリアの分解である^12,13。実際、いくつかの方法でこのエンドポイントを使用してマイトファジーを定量化しています。ただし、電子?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent or resource
Analytical balance	Mettler-Toledo
Bacto Agar	BD-Difco	214010
Bacto Peptone	BD-Difco	211677
Bacto Tryptone	BD-Difco	211705
Bacto Yeast extract	BD-Difco	212750
Calcium chloride	Sigma	C1016
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)	Sigma	C2920
Chemicals
Cholestrol	Thermo Fisher	C/5360/48
DMEM high glucose	Biological Industries	01-055-1A
Double distilled water (DDW)
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biological Industries	02-023-1A
FBS heat inactivated	Invitrogen	M7514
Gluteradehyde (25%)	Sigma	G5882
HEPES Buffer 1 M	Biological Industries	03-025-1B
L-gluatamine	Biological Industries	03-020-1B
Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent	Abcam	ab139487
Magnesium Sulfate	Sigma	M7506
Nonidet P 40	Sigma	74385
Paraformalydehyde (16%)	Electron Microscopy Sciences	15720
Poloxamer 188 Solution	Sigma	P5556
Potassium dihydrogen phosphate	Millipore	1.04873.1000
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P3786
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
Sodium Chloride	Bio-Lab	1903059100
Sodium Hydroxide	Gadot	1310732
Sodium phosphate dibasic dodecahydrate	Sigma	4273
Tetracycline hydrochloride	Sigma	87128-25G
Trypsin-EDTA	Biological Industries	03-052-1A
VL-850: 1,8-diaminooxy-octane	Patented
Glass/Plastic Disposables
0.22 μm syringe filter	Millex GV	SLGV033RS
1.7 mL Micro Centrifuge Tubes	Lifegene	LMCT1.7B-500
10 cm Petri plates	Corning	430167
1,000 mL Erlenmeyer Flask	IsoLab, Germany
15 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB15-500
35 mm Petri dishes	Bar Naor	BN9015810
500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm	Lifegene	LG-FPE205500S
50 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB50-500
Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm	Marienfeld	101152
Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass	Pyrex	99445-13
iBiDi 8 well μ-slides	iBiDi	80826
Microscope cover glass 24 x 40 mm	Bar Naor	BN1052421ECALN
Platinum iridium 0.25 mM wire	World Precision Instruments	PT1002
Instruments
Cell counter CellDrop BF	DeNovix	CellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400	Biosan	BS-010201-AAA
Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software	Nikon	CSU-W1
Olympus SZ61 stereo microscope	Olympus	SZ61
pH meter	Mettler-Toledo	MT30019032
Revolver Adjustable Lab Rotator	Labnet	H5600