Nachweis von Mitophagie in Caenorhabditis elegans und Säugetierzellen mit organellenspezifischen Farbstoffen

Zusammenfassung

Die Erforschung der Mitophagie durch Elektronenmikroskopie, genetische Sensoren und Immunfluoreszenz erfordert kostspielige Geräte, qualifiziertes Personal und einen erheblichen Zeitaufwand. Hier demonstrieren wir die Wirksamkeit eines kommerziellen Fluoreszenzfarbstoff-Kits bei der Quantifizierung des Mitophagie-Prozesses sowohl in Caenorhabditis elegans als auch in einer Leberkrebszelllinie.

Zusammenfassung

Mitochondrien sind essentiell für verschiedene biologische Funktionen, darunter Energieproduktion, Fettstoffwechsel, Kalziumhomöostase, Häm-Biosynthese, regulierter Zelltod und die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). ROS sind für wichtige biologische Prozesse von entscheidender Bedeutung. Wenn sie jedoch nicht kontrolliert werden, können sie zu oxidativen Schäden, einschließlich mitochondrialer Schäden, führen. Beschädigte Mitochondrien setzen mehr ROS frei, wodurch die Zellschädigung und der Krankheitszustand verstärkt werden. Ein homöostatischer Prozess, der als mitochondriale Autophagie (Mitophagie) bezeichnet wird, entfernt selektiv beschädigte Mitochondrien, die dann durch neue ersetzt werden. Es gibt mehrere Mitophagie-Signalwege, wobei der gemeinsame Endpunkt der Abbau der geschädigten Mitochondrien in Lysosomen ist.

Mehrere Methoden, darunter genetische Sensoren, Antikörper-Immunfluoreszenz und Elektronenmikroskopie, nutzen diesen Endpunkt zur Quantifizierung der Mitophagie. Jede Methode zur Untersuchung der Mitophagie hat ihre Vorteile, wie z. B. spezifisches Gewebe-/Zell-Targeting (mit genetischen Sensoren) und hohe Detailgenauigkeit (mit Elektronenmikroskopie). Diese Methoden erfordern jedoch oft teure Ressourcen, geschultes Personal und eine lange Vorbereitungszeit vor dem eigentlichen Versuch, etwa für die Erzeugung transgener Tiere. Hier stellen wir eine kostengünstige Alternative zur Messung der Mitophagie mit kommerziell erhältlichen Fluoreszenzfarbstoffen vor, die auf Mitochondrien und Lysosomen abzielen. Diese Methode misst effektiv die Mitophagie im Fadenwurm Caenorhabditis elegans und in menschlichen Leberzellen, was auf ihre potenzielle Effizienz in anderen Modellsystemen hinweist.

Einleitung

Mitochondrien sind für alle aeroben Tiere, einschließlich des Menschen, unerlässlich. Sie wandeln die chemische Energie von Biomolekülen durch oxidative Phosphorylierungⁱⁿ Adenosintriphosphat (ATP) um1, synthetisieren Häm², bauen Fettsäuren durch β Oxidation³ ab, regulieren die Homöostase von Kalzium⁴ und Eisen⁵, kontrollieren den Zelltod durch Apoptose⁶ und erzeugen reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die eine wichtige Rolle bei der Redoxhomöostase spielen⁷. Zwei komplementäre und gegensätzliche Prozesse erhalten die Integrität und ordnungsgemäße Funktion der Mitochondrien: die Synthese neuer mitochondrialer Komponenten (Biogenese) und die selektive Entfernung beschädigter Komponenten durch mitochondriale Autophagie (d. h. Mitophagie)⁸.

Mehrere Mitophagie-Signalwege werden durch Enzyme wie PINK1/Parkin und Rezeptoren wie FUNDC1, FKBP8 und BNIP/NIX ^9,10 vermittelt. Bemerkenswert ist, dass der selektive Abbau von mitochondrialen Komponenten unabhängig von der Autophagosomenmaschinerie (d. h. durch mitochondriale Vesikel erfolgen)¹¹. Die Endpunkte der verschiedenen selektiven Mitophagie-Signalwege sind jedoch ähnlich (d. h. mitochondrialer Abbau durch lysosomale Enzyme)^12,13. Aus diesem Grund beruhen verschiedene Methoden zur Identifizierung und Messung der Mitophagie auf der Kolokalisation von mitochondrialen und lysosomalen Markern 14,15,16,17 und verringerten Konzentrationen von mitochondrialen Proteinen/mitochondrialer DNA ¹⁸.

Im Folgenden finden Sie eine kurze Beschreibung der bestehenden experimentellen Methoden zur Messung der Mitophagie in tierischen Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie, wobei der Schwerpunkt auf der Mitophagie-Endpunktphase liegt.

Mitophagie-Biosensoren
Der mitochondriale Abbau findet in der sauren Umgebung des Lysosoms¹⁹ statt. Daher erleiden mitochondriale Komponenten, einschließlich Proteine, am Endpunkt des Mitophagieprozesses eine Verschiebung von einem neutralen zu einem sauren pH-Wert. Dieses Muster untermauert den Wirkmechanismus mehrerer Mitophagie-Biosensoren, darunter Mito-Rosella¹⁸ und Tandem mCherry-GFP-FIS1¹⁴. Diese Sensoren enthalten ein pH-empfindliches grünes Fluoreszenzprotein (GFP) und ein pH-unempfindliches rotes Fluoreszenzprotein (RFP). Daher sinkt am Endpunkt der Mitophagie das Grün-Rot-Fluoreszenz-Verhältnis aufgrund des Quenchens des GFP-Fluorophors signifikant. Die Haupteinschränkungen dieser Sensoren sind (1) ein möglicher Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) zwischen den Fluorophoren; (2) die unterschiedliche Reiferate von GFP und RFP; (3) Dissoziation zwischen GFP und RFP aufgrund der proteolytischen Spaltung des Polypeptids, das sie verbindet; (4) Überlappung von Fluoreszenz-Emissions; und (5) differentielle Fluorophorhelligkeit und -abschreckung^15,16.

Ein Sensor, der einige dieser Einschränkungen überwindet, ist der mitochondriale Keima-Sensor¹⁷. Der mt-Keima-Sensor (abgeleitet vom Korallenprotein Keima) zeigt einen einzigen Emissionspeak (620 nm) an. Seine Anregungsspitzen sind jedoch pH-empfindlich. Infolgedessen kommt es zu einem Übergang von einer grünen Anregung (440 nm) zu einer roten (586 nm) beim Wechsel von einem hohen pH-Wert zu einem sauren pH-Wert^16,17. Ein neuerer Mitophagie-Sensor, Mito-SRAI, hat das Feld erweitert, indem er Messungen in festen biologischen Proben ermöglicht²⁰. Trotz der vielen Vorteile genetischer Sensoren, wie z. B. der Fähigkeit, sie in bestimmten Geweben/Zellen zu exprimieren und sie auf bestimmte mitochondriale Kompartimente auszurichten, haben sie jedoch auch ihre Grenzen. Eine Einschränkung besteht darin, dass die genetischen Sensoren in Zellen oder Tieren exprimiert werden müssen, was zeit- und ressourcenintensiv sein kann.

Darüber hinaus kann die Expression der Sensoren in den Mitochondrien selbst die mitochondriale Funktion beeinflussen. Zum Beispiel erweitert die Expression von mitochondrialem GFP (mtGFP) in den Körperwandmuskeln des C. elegans-Wurms das mitochondriale Netzwerk²¹. Dieser Phänotyp hängt von der Funktion des stressaktivierten Transkriptionsfaktors ATFS-1 ab, der eine wesentliche Rolle bei der Aktivierung der ungefalteten Proteinantwort in Mitochondrien (UPR^mt) ^spielt21. Obwohl genetisch kodierte Mitochondrien/Mitophagie-Biosensoren für die Überwachung der Mitochondrienhomöostase in vivo äußerst nützlich sind, können sie genau den Prozess beeinflussen, für den sie entwickelt wurden.

Mitochondrien/Lysosomen-spezifische Antikörper und Farbstoffe
Eine weitere Strategie zum Testen der mitochondrialen/lysosomischen Kolokalisation ist die Verwendung von Antikörpern gegen mitochondriale/lysosomale Proteine, wie z. B. das mitochondriale äußere Membranprotein TOM20 und das lysosomal-assoziierte Membranprotein 1 (LAMP1)²². In den meisten Fällen werden Sekundärantikörper, die an einen Fluorophor konjugiert sind, verwendet, um das Fluoreszenzsignal mikroskopisch nachzuweisen. Eine andere Strategie besteht darin, genetische Konstrukte mit mitochondrialen/lysosomalen Farbstoffen zu kombinieren, wie z. B. die Expression eines LAMP1::GFP-Fusionskonstrukts in Zellen, während sie mit einem roten mitochondrialen Farbstoff (z. B. Mitotracker Red) gefärbt ^werden16. Diese Methoden sind zwar wirksam, erfordern aber spezifische Antikörper und beinhalten oft die Arbeit mit fixierten Proben oder die Erzeugung von Zellen/transgenen Tieren, die fluoreszenzmarkierte Mitochondrien/Lysosomen exprimieren.

In dieser Arbeit beschreiben wir die Verwendung eines kommerziellen Lysosom-/Mitochondrien-/Kernfärbekits zur Beurteilung der Mitophagie-aktivierenden Eigenschaften von synthetischem Diamin O,O (Oktan-1,8-diyl)bis(hydroxylamin), im Folgenden als VL-850²³ bezeichnet, in C. elegans-Würmern und der humanen Krebszelllinie Hep-3B (Abbildung 1). Das Färbekit enthält eine Mischung aus lysosomalen/mitochondrialen/nukleären Farbstoffen, die diese Organellen spezifisch anfärben²³. Wir haben dieses Kit bereits verwendet, um die Mitophagieaktivität von 1,8 Diaminooctan (im Folgenden als VL-004 bezeichnet) in C. elegans²³ nachzuweisen. Wichtig ist, dass wir die Ergebnisse des Färbekits mit dem Mito-Rosella-Biosensor und qPCR-Messungen des mitochondrial:nukleären DNA-Gehalts^{validierten 23}. Dieses Färbeset bietet die folgenden Vorteile. Erstens ist es nicht notwendig, transgene Tiere oder Zellen zu erzeugen, die einen mitochondrialen Biosensor exprimieren. Daher können wir unveränderte Wildtyp-Tiere oder -Zellen untersuchen und so viel Zeit, Geld und Arbeit sparen. Darüber hinaus kann, wie bereits erwähnt, die Expression mitochondrialer Biosensoren die mitochondriale Funktion verändern. Zweitens ist das Kit kostengünstig, einfach zu bedienen und schnell. Drittens demonstrieren wir die Methode zwar in C. elegans und menschlichen Zellen, könnten aber auch für andere Zelltypen und Organismen modifiziert werden.

Wie jede Methode hat auch das Färbekit-Protokoll Nachteile. Zum Beispiel wird die Inkubation der Würmer mit dem Reagenz in Abwesenheit von Nahrung durchgeführt (wir haben gesehen, dass selbst tote Bakterien die Färbeeffizienz erheblich verringern). Obwohl die Inkubationszeit relativ kurz ist, ist es möglich, dass auch in diesem Zeitraum die homöostatischen Reaktionen, einschließlich der Mitophagie, verändert werden. Darüber hinaus kann die Bindung der Farbstoffe an die ER/mitochondrialen/nukleären Proteine und andere Biomoleküle die Aktivität dieser Organellen beeinflussen. Anders als bei der Mitophagiemessung mit genetischen Sensoren arbeiten wir zudem mit Würmern und Zellen, die einer chemischen Fixierung unterzogen wurden. Daher ist es unmöglich, dieselben Würmer/Zellen zu unterschiedlichen Zeiten weiter zu überwachen. Daher empfehlen wir, verschiedene Methoden zu kombinieren, um die Funktion der Mitophagie in einem bestimmten physiologischen Prozess zu validieren. Im Folgenden präsentieren wir neue Daten, die zeigen, dass VL-850 robuste Mitophagie in C. elegans-Würmern und Hep-3B-Zellen induziert. Daher unterstützen diese Daten die Hypothese, dass VL-850 die Lebensdauer von C. elegans verlängert und C. elegans durch die Induktion einer gesunden Mitophagie vor oxidativen Schäden schützt . Als Positivkontrolle haben wir den Protonenionophor carbonylcyanid-4-(trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP) verwendet, der ein potenter Mitophagie-Induktor²⁴ ist.

Protokoll

HINWEIS: Zur Bequemlichkeit der Leser haben wir das Protokoll in zwei Teile unterteilt: Einer konzentriert sich auf das Protokoll zur Messung der Mitophagie in C. elegans und der andere konzentriert sich auf das Protokoll zur Messung der Mitophagie in Leberzellen. Die Liste der Materialien finden Sie in der bereitgestellten Materialtabelle .

1. Das C. elegans-Protokoll

1. Vorbereitung der Nematoden-Wachstumsmedien (NGM)-Platten und des Escherichia coli OP50-Bakterienbestands
   HINWEIS: Zur Klarstellung: Obwohl wir die Standardprotokolle für die Herstellung der NGM-Platten und des OP50-Bakterienbestands^25,26 befolgt haben, erkennen wir an^, dass es zwischen verschiedenen Labors zu Abweichungen in diesen Protokollen kommen kann. Daher haben wir die vollständigen Protokolle beigefügt, um eine genaue Replikation des Experiments zu gewährleisten.
   1. Stellen Sie einen 1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 6, her, indem Sie ~150 ml 1 M K 2 HPO 4zu 500 ml 1 M KH₂PO₄ Lösung hinzufügen, bis pH 6 erreicht ist. Sterilisieren Sie den Puffer, indem Sie ihn durch ein 0,22-μm-Vakuumfilter-/Lagersystem leiten.
   2. Stellen Sie 0,1 M Calciumchlorid (CaCl 2) und Magnesiumsulfat (MgSO₄) her und sterilisieren Sie sie mit einem_0,2 μm Spritzenvorsatzfilter.
   3. Bereiten Sie 5 mg/ml Cholesterin in absolutem Ethanol vor.
      HINWEIS: Da das Cholesterin in Ethanol aufbereitet wird, filtrieren Sie es nicht.
   4. Bereiten Sie NGM-Agar vor, indem Sie 1,5 g Natriumchlorid (NaCl), 1,25 g Pepton und 8,5 g Agar in 500 ml doppelt destilliertem Wasser (DDW) auflösen. Autoklavieren und auf ~55 °C abkühlen lassen.
   5. Unter sterilen Bedingungen werden 12,5 ml Kaliumphosphatpuffer (pH 6), 0,5 ml 0,1 M CaCl₂, 0,5 ml 0,1 M_MgSO4 und 1 ml 5 mg/ml Cholesterin zugegeben. Nach jeder Zugabe gut mischen.
   6. Geben Sie 4 ml des geschmolzenen NGM-Agars auf jede 35-mm-Platte. Lassen Sie das Geschirr über Nacht bei Raumtemperatur (RT, ~21 °C) fest werden.
   7. Um Luria-Bertani (LB)-Agarplatten herzustellen, lösen Sie 5 g NaCl, 5 g Trypton, 2,5 g Hefeextrakt und 7,5 g Agar in 400 ml destilliertem, deionisiertem Wasser (DDW) auf, stellen Sie den pH-Wert der Lösung auf 7,0 ein, bringen Sie das Volumen mit DDW auf 500 ml und autoklavieren. Sobald die Lösung auf 55 °C abgekühlt ist, gießen Sie 25 ml der Mischung in jede 90-mm-Petrischale und lassen Sie die Platten 2 Tage lang bei Raumtemperatur trocknen. Als nächstes werden OP50-Bakterien auf den getrockneten LB-Platten aus dem Glycerinvorrat entfernt und über Nacht bei 37 °C inkubiert, um einzelne Kolonien zu erhalten.
   8. Bereiten Sie 2x Hefetrypton (YT) vor, indem Sie 8 g Trypton, 5 g Hefeextrakt und 2,5 g Natriumchlorid (NaCl) in 0,5 l DDW auflösen. Stellen Sie den pH-Wert auf 7 ein und autoklavieren Sie.
   9. Nach dem Abkühlen wird eine OP50-Bakterienkolonie von der frisch gestreiften LB-Platte in 50 ml 2x YT-Medium in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben beimpft. Bei 37 °C und 250 U/min auf eine optische Dichte (OD₆₀₀) von ca. 0,6 schütteln.
2. Vorbereitung des Fahrzeugs und der Versuchsplatten
   1. Geben Sie 100 μl OP50-Bakterien in die Mitte jeder 35-mm-NGM-Agarplatte. Über Nacht bei RT (Raumtemperatur, 21 °C) trocknen.
   2. 0,5 mM VL-850 in DMSO vorbereiten und mit M9-Puffer (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na₂HPO 4, 86 mM NaCl, pH 7 und 1 mM_MgSO) auf 10 mM VL-850 verdünnen₄)²⁶. Vergewissern Sie sich, dass der pH-Wert 7,0 beträgt (wenn nicht, titrieren Sie mit 0,1 M HCl) und sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22 μm Spritzenvorsatzfilter. Bereiten Sie das Fahrzeug wie oben beschrieben vor, jedoch ohne das Medikament (in diesem Fall VL-850). Stellen Sie 50 mM FCCP in DMSO her, verdünnen Sie es mit M9-Puffer auf 1 mM FCCP und sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22-μm-Spritzenvorsatzfilter.
   3. Geben Sie 25 μl Vehikel (Negativkontrolle), FCCP (Positivkontrolle; 5 μM) oder VL-850 (experimentelle Behandlung; 62,5 μM) zu separat gesäten NGM-Platten auf dem Bakterienrasen.
   4. Decken Sie die Platten mit Alufolie ab und lassen Sie sie bei RT (Raumtemperatur, 21 °C) trocknen. Verwenden Sie die Platten nach ~16 h.
3. Gewinnung synchronisierter junger erwachsener C. elegans-Hermaphroditen
   1. 1 l M9-Puffer mit 22 mM_KH2PO4, 42 mM Na2HPO4 und 86mM NaCl herstellen. Durch Autoklavieren sterilisieren und abkühlen lassen. Nach dem Abkühlen 1 ml 1 mM_MgSO4 (0,22 μm filtersterilisiert) hinzufügen.
   2. Mischen Sie 0,8 ml 2,5 N Natriumhydroxid und 1 ml einer 5%igen Natriumhypochloritlösung mit 2,2 ml DDW, um eine 4 ml alkalische Hypochloritlösung zu erhalten (Endkonzentration von 0,5 N für Natriumhydroxid und 1,25 % für Natriumhypochlorit).
   3. Sammeln Sie die Würmer (trächtige Hermaphroditen) in einem konischen 15-ml-Röhrchen, indem Sie die NGM-Platten 3x mit 1 ml M9-Puffer waschen, um sicherzustellen, dass alle Mütter im Röhrchen gesammelt wurden.
   4. Sedimentieren Sie die Würmer durch Zentrifugation bei 500 × g für 1 Minute und entsorgen Sie den Überstand, bis ein Volumen von 1 ml übrig bleibt.
   5. Fügen Sie 1 ml alkalische Hypochloritlösung hinzu und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen 5x umdrehen. Besprühen Sie das Röhrchen 3 Minuten lang vorsichtig, um die Freisetzung der Eier zu unterstützen, und beobachten Sie den Zustand der Würmer unter einem Sezierstereoskop.
   6. Wenn etwa 50 % der Würmer gebrochen sind, fügen Sie 5 ml M9-Puffer hinzu und sedimentieren Sie die Eier sofort, indem Sie sie 1 Minute lang bei 500 × g zentrifugieren.
   7. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören. Fügen Sie 5 ml M9-Puffer hinzu und wiederholen Sie den Waschvorgang 2x.
   8. Entfernen Sie den Überstand, bis noch 2 ml übrig sind, und drehen Sie das Röhrchen (360°-Drehung) bei 20 U/min für ~16 h (RT, 21 °C), um synchronisierte L1-Larven zu erhalten. Nehmen Sie aus diesem Röhrchen einen 5-μl-Tropfen auf einen Glasobjektträger, zählen Sie die Anzahl der Larven unter einem Stereoskop, wiederholen Sie diesen Schritt 3x, nehmen Sie einen Durchschnitt der drei Zählungen und schätzen Sie die Anzahl der Würmer pro Mikroliter (μl). Fügen Sie auf der Grundlage dieser Berechnungen ~200 Larven pro NGM-Platte hinzu, die mit OP50-Bakterien besiedelt ist.
   9. Die L1-Larven werden bei 21 °C für ~48 h bis zum jungen Erwachsenenstadium gezüchtet.
4. Medikamentöse Behandlung und mikroskopisches Verfahren
   1. Legen Sie 100 Würmer auf jede der Versuchs- oder Kontrollplatten. Stellen Sie sicher, dass die Negativ-, Positiv- und Experimentierplatten das Fahrzeug, 5 μM FCCP bzw. 62,5 μM VL-850 enthalten. Bei 21 °C 6 h inkubieren.
   2. Verwenden Sie 1 ml M9-Puffer, um die Würmer von jeder Platte in ein 1,7-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu waschen. Das Röhrchen kurz (~3 s) in einer Minizentrifuge drehen. Als nächstes entsorgen Sie den Überstand, indem Sie den M9-Puffer vorsichtig herauspipettieren, ohne das Wurmpellet zu stören. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 2x und entfernen Sie dann vorsichtig den Überstand, ohne das Wurmpellet zu stören.
   3. Fügen Sie dem Wurmpellet 200 μl M9-Puffer hinzu, der 0,1 % v/v Poloxamer 188, 0,1 % v/v Pluronic F127 und 2 μl des Färbekit-Reagenzes enthält. Lassen Sie das Gemisch 1 h bei RT (Raumtemperatur, 21 °C) mit 20 U/min (360°-Drehung) rotieren. Um die Farbstoffe vor Licht zu schützen, decken Sie die Röhrchen mit Alufolie ab.
   4. Schleudern Sie die Würmer vorsichtig, wie in Schritt 1.3.4 beschrieben. Entfernen Sie dann die Färbelösung, ohne das Wurmpellet zu stören. Als nächstes werden die Würmer wie in Schritt 1.3.2 beschrieben gewaschen und in eine NGM-Agar-Platte mit Saatgut überführt, die die entsprechende Behandlung enthält – z. B. werden mit FCCP behandelte Würmer in eine Platte mit FCCP überführt. Decken Sie die Platten mit Alufolie ab, da das Färbereagenz lichtempfindlich ist.
      HINWEIS: Wir haben die Würmer auf Kulturplatten übertragen, die Bakterien und das entsprechende Behandlungsmittel enthalten, um die Hintergrundgeräusche aufgrund von überschüssigem Farbstoff zu minimieren. Zum Beispiel wurden Würmer, die mit FCCP behandelt wurden, auf FCCP-ergänzte Platten übertragen und so weiter.
   5. Waschen Sie die Würmer von den Platten mit 1 ml M9-Puffer in frische Mikrozentrifugenröhrchen. Waschen Sie die Würmer auf die gleiche Weise 2x. Als nächstes fixieren Sie die Würmer 30 Minuten lang mit 1% Formaldehyd auf Eis und waschen Sie die Würmer 3x mit 1 ml M9-Puffer, um Formaldehydreste zu entfernen. Schleudern Sie die Würmer nach dem Waschen zu einem Pellet und saugen Sie die maximale Menge an Überstand ab, wobei das Wurmpellet in 10 μl M9 intakt bleibt.
   6. Um 2,5 % Agarose herzustellen, wiegen Sie 0,125 g Agarose in ein 10-ml-Borosilikatglas-Reagenzglas, fügen Sie 5 ml M9-Puffer hinzu und lösen Sie die Agarose auf, indem Sie das Röhrchen vorsichtig mit einem Bunsenbrenner erhitzen. Übertragen Sie die geschmolzene Agarose in ein Trockenbad bei 75 °C und geben Sie mit einer 1-ml-Spitze 100 μl der geschmolzenen Agarose auf ein Deckgläser-Mikroskop-Deckglas (24 mm x 60 mm). Legen Sie sofort einen weiteren Objektträger senkrecht auf den Agarosetropfen und bilden Sie eine Kreuzform. Warten Sie ~2 Minuten und trennen Sie die Objektträger vorsichtig, indem Sie (vorsichtig) auf das obere Deckglas drücken, so dass das Agarosepad auf dem unteren Deckobjektträger verbleibt.
      Anmerkungen: Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Agarose in der Tube erhitzen, und stellen Sie sicher, dass die Tube vom Körper entfernt gehalten wird. Schneiden Sie den Rand der 1-ml-Spitze ab, um die Koagulation der Agarose zu minimieren.
   7. Übertragen Sie die Würmer mit einer Pasteur-Glaspipette auf das Agarose-Pad (d. h. die gesamte Menge im Röhrchen, ~10 μL). Entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit mit einem Docht aus einem Labortuch und decken Sie die Würmer dann mit einem kleineren Abdeckschieber (24 mm x 40 mm) ab. Tragen Sie transparenten Nagellack auf den Rand des kleineren Abdeckobjektträgers auf, um eine Verdunstung zu verhindern. Legen Sie den Objektträger in eine dunkle Box, um ihn vor Licht zu schützen.
   8. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop, um die Würmer innerhalb von 24 Stunden bei den entsprechenden Wellenlängen (siehe unten) mit einem 60-fachen Vergrößerungsobjektiv abzubilden.
      1. Legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch.
      2. Öffnen Sie die Bildbearbeitungssoftware und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den grauen Bereich der Software. Offene Akquise | Ti2 Vollpolster | ND-Akquisition | LUTs , indem Sie auf die Optionen im Popup-Fenster klicken, das als Ergebnis des Rechtsklicks angezeigt wird.
      3. Wählen Sie unter Ti2 Full Pad die Option 60x aus.
      4. Wählen Sie unter "Erfassung" die Option "Okular-DIA" und stellen Sie die Würmer mit dem Mikroskop-Feinfokusknopf in den Fokus. Wählen Sie unter "Erfassung" die Option "Rotationsdatenträger" aus, und wählen Sie die Option "16-Bit - Kein Binning" aus. Stellen Sie für jeden Fluoreszenzfilter die Belichtungszeit auf 500 ms und für Hellfeld auf 20 ms ein. Sobald diese Parameter festgelegt sind, wählen Sie Jetzt ausführen aus, und warten Sie, bis das Ausgabebild als ND2-Datei generiert wurde.
         HINWEIS: Die Belichtungszeit muss experimentell bestimmt werden, da verschiedene Bildgebungsaufbauten unterschiedliche Eigenschaften haben. Verwenden Sie Lookup-Tabellen (LUTs), um die Fluoreszenzintensität für jede Wellenlänge zu untersuchen.
5. Bildanalyse
   1. Öffnen Sie die konfokalen Bilder (hier Nikon ND2-Dateien) in ImageJ²⁷ mit dem Kolokalisations-Plugin. Jede ND-Datei enthält Bildebenen, die bei drei Wellenlängen (mit DAPI-, GFP/FITC- [grün] und Texas Red [rot]-Filtern) und sichtbarem Licht aufgenommen wurden. Um auf diese Bilder zuzugreifen, öffnen Sie die ND-Datei auf dem ImageJ-Server, und wählen Sie im Dialogfeld die Option Bilder teilen aus. Arbeiten Sie mit Hellfeld- (BF), Grünkanal- und Rotkanalbildern.
   2. Generieren Sie Duplikate dieser Bilder, um das Originalbild unberührt zu lassen, indem Sie auf Bild | Duplizieren oder mit der Tastenkombination Umschalt + D.
   3. Um den Hintergrund zu verkleinern, erzeugen Sie, wie oben erwähnt, ein weiteres Duplikat des Bildes. Subtrahieren Sie den Hintergrund mit einem Rollradius von 100 und wählen Sie die Option Hintergrund erstellen (nicht subtrahieren), um ein Bild mit dem Hintergrund des angegebenen Bildes zu erstellen. Gehen Sie als Nächstes zu Prozess | Bildrechner und subtrahieren Sie das erste duplizierte Bild vom zweiten duplizierten Bild. Verwenden Sie die resultierenden Bilder für die Kolokalisierungsanalyse.
   4. Um das Kolokalisierungs-Plugin zu verwenden, konvertieren Sie die Bilder des grünen Kanals und des roten Kanals in 8-Bit. Klicken Sie dazu auf Bild | Typ | 8 Bit.
   5. Klicken Sie auf Plugins | Kolokalisierung. Um die Kolokalisation von Mitochondrien- und Lysosomensignalen mit dem Kolokalisations-Plugin (siehe oben) zu messen, verwenden Sie die folgenden Parameter: Verhältnis = 75%, Schwellenwert roter Kanal = 80,0, Schwellenwert grüner Kanal = 50,0. Die Ausgabe ist ein 8-Bit-Binärbild, das kolokalisierte Punktzahlen und eine Kombination der drei 8-Bit-Bilder (grün, rot und das kolokalisierte Bild) in einem RGB-Bild enthält.
   6. Konzentriere dich auf die Puncta im Kopf-Körper-Wand-Muskel der Würmer, indem du diesen Bereich manuell auswählst und eine Maske erstellst, indem du auf Bearbeiten | Selektion | Maske erstellen, die den gewünschten Bereich auswählt (Abbildung 2A, B). Entfernen Sie selektiv andere gefärbte Elemente (z. B. die Rachenmuskulatur), um die Muskelregion zwischen Kopf, Körper und Wand zu analysieren.
   7. Um die Partikel im Interessenbereich (ROI) auszuwählen, wählen Sie die kolokalisierten 8-Bit- und Maskenbilder mit dem Bildrechner aus. Verwenden Sie dann die Operation AND (Abbildung 3A), um den Punkt im ROI auszuwählen. Dadurch wird ein Bild mit Punktzahl im ROI erzeugt (Abbildung 3B).
   8. Um den Bereich der kolokalisierten Mitochondrien und Lysosomen zu analysieren, wählen Sie Analysieren | Analysieren Sie Partikel und messen Sie die Summierung der Punktzahl zwischen 0,1625 μm2 und 4 μm2.

2. Das Hep-3B-Krebszellprotokoll

1. Vorbereiten der Arzneimittelstammlösung
   1. Bereiten Sie 100 mM VL-850 in DMSO vor. Verdünnen Sie es auf 5 mM mit 0,5 M HEPES-Puffer, pH 7,3, und sterilisieren Sie die Lösung mit einem 0,22 μm Spritzenvorsatzfilter. Bereiten Sie dann das Fahrzeug wie zuvor beschrieben vor, jedoch ohne das Medikament (in diesem Fall VL-850).
2. Kultivierung von Hep-3B-Zellen für das Experiment, die medikamentöse Behandlung und das Mikroskopieverfahren
   1. Hep-3B-Zellen werden in 10 cm großen Gewebekulturplatten gezüchtet, die Dulbeccos modifiziertes Adlermedium (DMEM) enthalten, das mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FBS), 2 % L-Glutamin und 1 % Tetracyclin (im Folgenden als vollständiges DMEM bezeichnet) ergänzt wird. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5 % CO₂.
   2. Wählen Sie eine Platte mit Hep-3B-Zellen mit einer Zellkonfluenz von 70 % bis 80 % (logarithmische Wachstumsphase), entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Platte mit 5 ml vorgewärmter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Entfernen Sie das PBS und inkubieren Sie die Zellen mit 1 ml vorgewärmtem 0,25% Trypsin/0,02% EDTA für ~3 min bei 37 °C; Betrachten Sie die Zellen unter einem Gewebekulturmikroskop (10x). Stoppen Sie die Trypsinverdauung, wenn die Zellen rund werden, und beginnen Sie mit der Dissoziation von der Platte, indem Sie 5 ml vollständiges DMEM hinzufügen. Zentrifugieren Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 1.000 × g , entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 5 ml vollständigem DMEM.
   3. Bestimmen Sie die Zellkonzentration. Mischen Sie 50 μl der Zellsuspension mit 50 μl Trypanblau. Zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zellzähler oder mit einem Hämozytometer 5x und nehmen Sie einen Durchschnitt dieser Zählungen, um die Genauigkeit der Zählungen sicherzustellen.
   4. Säen Sie 42.000 Hep3G-Zellen in jedem 8-Well-μ-Objektträger in 400 μl vollständigem DMEM (wie oben beschrieben). Inkubieren Sie die Zellen für 24 h bei 37 °C und 5% CO₂.
   5. Entfernen Sie nach 24 Stunden bei ~80%-85% Konfluenz 250 μl Medium aus jeder der Vertiefungen und fügen Sie 50 μl Medium mit der entsprechenden Behandlung oder dem entsprechenden Vehikel hinzu. Um diesem Protokoll zu folgen, behandeln Sie die Zellen mit 100 μM VL-850, 5 μM FCCP und einem Vehikel als Kontrolle.
   6. Nach der 6-stündigen Inkubation mit den Verbindungen werden 50 μl Medium in jede Vertiefung gegeben, die das Färbereagenz enthält (0,5 μl Farbstoff für 250 μl in jeder Vertiefung). Inkubieren Sie die Zellen mit dem Farbstoff für 30 min bei 37 °C und 5% CO₂.
      Anmerkungen: Da das Färbereagenz lichtempfindlich ist, minimieren Sie die Lichteinwirkung, indem Sie die Proben mit Aluminiumfolie abdecken und in einer Umgebung mit schwachem Licht arbeiten (wenn möglich).
   7. Entfernen Sie mit einer 200-μl-Pipette vorsichtig das gesamte Medium (250 μl) aus jeder Vertiefung und waschen Sie dann die Zellen mit 200 μl vorgewärmtem PBS.
   8. Fixieren Sie die Zellen mit 200 μl Fixierlösung mit 4 % Formaldehyd und 2,5 % Glutaraldehyd, die in PBS für 15 Minuten bei RT hergestellt wurde.
   9. Die Fixierlösung dekantieren und kurz mit 200 μl PBS waschen.
   10. Fügen Sie 200 μl PBS hinzu, halten Sie die Zellen abgedeckt und lichtgeschützt bei 4 °C und bilden Sie innerhalb von 24 Stunden ab.
       HINWEIS: Wir haben das konfokale Spinning-Disk-Mikroskop in vier Kanälen verwendet, einschließlich DIC, TRITC, FITC und DAPI, wie in Schritt 1.4.8. Wir haben ~300 Zellen pro Behandlung abgebildet.
3. Bildanalyse
   1. Führen Sie die Schritte 1.5.1-1.5.5 aus. Um den ROI der Zellen zu erhalten, generieren Sie ein Bild, das den Bereich der Zellen hervorhebt. Wählen Sie dazu ein RGB-Bild (Colokalized Points) (Abbildung 4A). Um den gesamten Zellbereich auszuwählen, wählen Sie Prozess | Binär | Erstellen Sie eine Maske, um ein Binärbild zu erhalten (Abbildung 4B). Um den Bereich der Zelle zu analysieren, wählen Sie Analysieren | Partikel analysieren, und messen Sie alle Partikel im Bild von 0 bis unendlich, was die Standardeinstellung für Partikel analysieren ist.
   2. Um den Bereich der kolokalisierten Mitochondrien und Lysosomen zu analysieren, wählen Sie ein kolokalisiertes 8-Bit-Bild aus und konvertieren Sie es in Binärbild, indem Sie Prozess | Binär | Binär erstellen, wählen Sie Analysieren | Analysieren Sie Partikel und messen Sie die Summierung von Puncta zwischen 0,1625 μm2 und 4 μm2. Um die kolokalisierte Punktzahl zu messen, teilen Sie die Fläche der kolokalisierten Mitochondrien und Lysosomen durch die Gesamtzellfläche.

Ergebnisse

Induktion einer robusten Mitophagieantwort sowohl in C. elegans-Würmern als auch in Hep-3B-Zellen mit VL-850
VL-850 schützt C. elegans-Würmer und menschliche Keratinozyten (HaCaT-Zellen) vor oxidativem Stress²³. Um seinen Wirkmechanismus weiter zu erforschen, untersuchten wir, ob VL-850 Mitophagie in C. elegans und anderen menschlichen Zellen induziert. Um dies zu testen, setzten wir C. elegans-Würmer (junge Erwachsene, 3 Tage nach L1) 6 ...

Diskussion

An mehreren Mitophagie-Signalwegen sind verschiedene Proteine und Biomoleküle (z. B. Cardiolipin²⁹) beteiligt. Der Endpunkt dieser Signalwege ist jedoch ähnlich - der Abbau von Mitochondrien durch lysosomale Enzyme^12,13. Tatsächlich nutzen mehrere Methoden diesen Endpunkt, um die Mitophagie zu quantifizieren. Einige Methoden, wie z. B. die Elektronenmikroskopie, erfordern jedoch den Zugang zu kostspieligen Geräten, geschulten Experten ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent or resource
Analytical balance	Mettler-Toledo
Bacto Agar	BD-Difco	214010
Bacto Peptone	BD-Difco	211677
Bacto Tryptone	BD-Difco	211705
Bacto Yeast extract	BD-Difco	212750
Calcium chloride	Sigma	C1016
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)	Sigma	C2920
Chemicals
Cholestrol	Thermo Fisher	C/5360/48
DMEM high glucose	Biological Industries	01-055-1A
Double distilled water (DDW)
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biological Industries	02-023-1A
FBS heat inactivated	Invitrogen	M7514
Gluteradehyde (25%)	Sigma	G5882
HEPES Buffer 1 M	Biological Industries	03-025-1B
L-gluatamine	Biological Industries	03-020-1B
Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent	Abcam	ab139487
Magnesium Sulfate	Sigma	M7506
Nonidet P 40	Sigma	74385
Paraformalydehyde (16%)	Electron Microscopy Sciences	15720
Poloxamer 188 Solution	Sigma	P5556
Potassium dihydrogen phosphate	Millipore	1.04873.1000
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P3786
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
Sodium Chloride	Bio-Lab	1903059100
Sodium Hydroxide	Gadot	1310732
Sodium phosphate dibasic dodecahydrate	Sigma	4273
Tetracycline hydrochloride	Sigma	87128-25G
Trypsin-EDTA	Biological Industries	03-052-1A
VL-850: 1,8-diaminooxy-octane	Patented
Glass/Plastic Disposables
0.22 μm syringe filter	Millex GV	SLGV033RS
1.7 mL Micro Centrifuge Tubes	Lifegene	LMCT1.7B-500
10 cm Petri plates	Corning	430167
1,000 mL Erlenmeyer Flask	IsoLab, Germany
15 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB15-500
35 mm Petri dishes	Bar Naor	BN9015810
500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm	Lifegene	LG-FPE205500S
50 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB50-500
Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm	Marienfeld	101152
Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass	Pyrex	99445-13
iBiDi 8 well μ-slides	iBiDi	80826
Microscope cover glass 24 x 40 mm	Bar Naor	BN1052421ECALN
Platinum iridium 0.25 mM wire	World Precision Instruments	PT1002
Instruments
Cell counter CellDrop BF	DeNovix	CellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400	Biosan	BS-010201-AAA
Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software	Nikon	CSU-W1
Olympus SZ61 stereo microscope	Olympus	SZ61
pH meter	Mettler-Toledo	MT30019032
Revolver Adjustable Lab Rotator	Labnet	H5600