Nachweis von Mitophagie in Caenorhabditis elegans und Säugetierzellen mit organellenspezifischen Farbstoffen

Zusammenfassung

Die Erforschung der Mitophagie durch Elektronenmikroskopie, genetische Sensoren und Immunfluoreszenz erfordert kostspielige Geräte, qualifiziertes Personal und einen erheblichen Zeitaufwand. Hier demonstrieren wir die Wirksamkeit eines kommerziellen Fluoreszenzfarbstoff-Kits bei der Quantifizierung des Mitophagie-Prozesses sowohl in Caenorhabditis elegans als auch in einer Leberkrebszelllinie.

Zusammenfassung

Mitochondrien sind essentiell für verschiedene biologische Funktionen, darunter Energieproduktion, Fettstoffwechsel, Kalziumhomöostase, Häm-Biosynthese, regulierter Zelltod und die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). ROS sind für wichtige biologische Prozesse von entscheidender Bedeutung. Wenn sie jedoch nicht kontrolliert werden, können sie zu oxidativen Schäden, einschließlich mitochondrialer Schäden, führen. Beschädigte Mitochondrien setzen mehr ROS frei, wodurch die Zellschädigung und der Krankheitszustand verstärkt werden. Ein homöostatischer Prozess, der als mitochondriale Autophagie (Mitophagie) bezeichnet wird, entfernt selektiv beschädigte Mitochondrien, die dann durch neue ersetzt werden. Es gibt mehrere Mitophagie-Signalwege, wobei der gemeinsame Endpunkt der Abbau der geschädigten Mitochondrien in Lysosomen ist.

Mehrere Methoden, darunter genetische Sensoren, Antikörper-Immunfluoreszenz und Elektronenmikroskopie, nutzen diesen Endpunkt zur Quantifizierung der Mitophagie. Jede Methode zur Untersuchung der Mitophagie hat ihre Vorteile, wie z. B. spezifisches Gewebe-/Zell-Targeting (mit genetischen Sensoren) und hohe Detailgenauigkeit (mit Elektronenmikroskopie). Diese Methoden erfordern jedoch oft teure Ressourcen, geschultes Personal und eine lange Vorbereitungszeit vor dem eigentlichen Versuch, etwa für die Erzeugung transgener Tiere. Hier stellen wir eine kostengünstige Alternative zur Messung der Mitophagie mit kommerziell erhältlichen Fluoreszenzfarbstoffen vor, die auf Mitochondrien und Lysosomen abzielen. Diese Methode misst effektiv die Mitophagie im Fadenwurm Caenorhabditis elegans und in menschlichen Leberzellen, was auf ihre potenzielle Effizienz in anderen Modellsystemen hinweist.

Einleitung

Mitochondrien sind für alle aeroben Tiere, einschließlich des Menschen, unerlässlich. Sie wandeln die chemische Energie von Biomolekülen durch oxidative Phosphorylierungⁱⁿ Adenosintriphosphat (ATP) um1, synthetisieren Häm², bauen Fettsäuren durch β Oxidation³ ab, regulieren die Homöostase von Kalzium⁴ und Eisen⁵, kontrollieren den Zelltod durch Apoptose⁶ und erzeugen reaktive Sauerstoffspezies (ROS), die eine wichtige Rolle bei der Redoxhomöostase spielen⁷. Zwei komplementäre und gegensätzliche....

Protokoll

HINWEIS: Zur Bequemlichkeit der Leser haben wir das Protokoll in zwei Teile unterteilt: Einer konzentriert sich auf das Protokoll zur Messung der Mitophagie in C. elegans und der andere konzentriert sich auf das Protokoll zur Messung der Mitophagie in Leberzellen. Die Liste der Materialien finden Sie in der bereitgestellten Materialtabelle .

1. Das C. elegans-Protokoll

1. Vorbereitung der Nematoden-Wachstumsmedien (NGM)-Platten und des Escherichia coli OP50-Bakterienbestands
   HINWEIS: Zur Klarstellung: Obwohl wir die Standardprotokolle für die Herstellung der NGM-Platten ....

Diskussion

An mehreren Mitophagie-Signalwegen sind verschiedene Proteine und Biomoleküle (z. B. Cardiolipin²⁹) beteiligt. Der Endpunkt dieser Signalwege ist jedoch ähnlich - der Abbau von Mitochondrien durch lysosomale Enzyme^12,13. Tatsächlich nutzen mehrere Methoden diesen Endpunkt, um die Mitophagie zu quantifizieren. Einige Methoden, wie z. B. die Elektronenmikroskopie, erfordern jedoch den Zugang zu kostspieligen Geräten, geschulten Experten .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent or resource
Analytical balance	Mettler-Toledo
Bacto Agar	BD-Difco	214010
Bacto Peptone	BD-Difco	211677
Bacto Tryptone	BD-Difco	211705
Bacto Yeast extract	BD-Difco	212750
Calcium chloride	Sigma	C1016
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)	Sigma	C2920
Chemicals
Cholestrol	Thermo Fisher	C/5360/48
DMEM high glucose	Biological Industries	01-055-1A
Double distilled water (DDW)
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biological Industries	02-023-1A
FBS heat inactivated	Invitrogen	M7514
Gluteradehyde (25%)	Sigma	G5882
HEPES Buffer 1 M	Biological Industries	03-025-1B
L-gluatamine	Biological Industries	03-020-1B
Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent	Abcam	ab139487
Magnesium Sulfate	Sigma	M7506
Nonidet P 40	Sigma	74385
Paraformalydehyde (16%)	Electron Microscopy Sciences	15720
Poloxamer 188 Solution	Sigma	P5556
Potassium dihydrogen phosphate	Millipore	1.04873.1000
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P3786
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
Sodium Chloride	Bio-Lab	1903059100
Sodium Hydroxide	Gadot	1310732
Sodium phosphate dibasic dodecahydrate	Sigma	4273
Tetracycline hydrochloride	Sigma	87128-25G
Trypsin-EDTA	Biological Industries	03-052-1A
VL-850: 1,8-diaminooxy-octane	Patented
Glass/Plastic Disposables
0.22 μm syringe filter	Millex GV	SLGV033RS
1.7 mL Micro Centrifuge Tubes	Lifegene	LMCT1.7B-500
10 cm Petri plates	Corning	430167
1,000 mL Erlenmeyer Flask	IsoLab, Germany
15 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB15-500
35 mm Petri dishes	Bar Naor	BN9015810
500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm	Lifegene	LG-FPE205500S
50 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB50-500
Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm	Marienfeld	101152
Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass	Pyrex	99445-13
iBiDi 8 well μ-slides	iBiDi	80826
Microscope cover glass 24 x 40 mm	Bar Naor	BN1052421ECALN
Platinum iridium 0.25 mM wire	World Precision Instruments	PT1002
Instruments
Cell counter CellDrop BF	DeNovix	CellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400	Biosan	BS-010201-AAA
Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software	Nikon	CSU-W1
Olympus SZ61 stereo microscope	Olympus	SZ61
pH meter	Mettler-Toledo	MT30019032
Revolver Adjustable Lab Rotator	Labnet	H5600