Detección de mitofagia en Caenorhabditis elegans y células de mamíferos utilizando colorantes específicos de orgánulos

Resumen

Explorar la mitofagia a través de microscopía electrónica, sensores genéticos e inmunofluorescencia requiere equipos costosos, personal calificado y una inversión de tiempo significativa. Aquí, demostramos la eficacia de un kit de colorante de fluorescencia comercial para cuantificar el proceso de mitofagia tanto en Caenorhabditis elegans como en una línea celular de cáncer de hígado.

Resumen

Las mitocondrias son esenciales para diversas funciones biológicas, incluida la producción de energía, el metabolismo de los lípidos, la homeostasis del calcio, la biosíntesis del hemo, la muerte celular regulada y la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). Las ROS son vitales para los procesos biológicos clave. Sin embargo, cuando no se controlan, pueden provocar lesiones oxidativas, incluido el daño mitocondrial. Las mitocondrias dañadas liberan más ROS, intensificando así la lesión celular y el estado de la enfermedad. Un proceso homeostático llamado autofagia mitocondrial (mitofagia) elimina selectivamente las mitocondrias dañadas, que luego son reemplazadas por otras nuevas. Existen múltiples vías de mitofagia, siendo el punto final común la descomposición de las mitocondrias dañadas en los lisosomas.

Varias metodologías, incluidos los sensores genéticos, la inmunofluorescencia de anticuerpos y la microscopía electrónica, utilizan este criterio de valoración para cuantificar la mitofagia. Cada método para examinar la mitofagia tiene sus ventajas, como la orientación específica de tejidos/células (con sensores genéticos) y gran detalle (con microscopía electrónica). Sin embargo, estos métodos a menudo requieren recursos costosos, personal capacitado y un largo tiempo de preparación antes del experimento real, como para crear animales transgénicos. Aquí, presentamos una alternativa rentable para medir la mitofagia utilizando tintes fluorescentes disponibles comercialmente dirigidos a mitocondrias y lisosomas. Este método mide eficazmente la mitofagia en el nematodo Caenorhabditis elegans y las células hepáticas humanas , lo que indica su eficiencia potencial en otros sistemas modelo.

Introducción

Las mitocondrias son esenciales para todos los animales aeróbicos, incluidos los humanos. Convierten la energía química de las biomoléculas en trifosfato de adenosina (ATP) a través de la fosforilación oxidativa¹, sintetizan hemo², degradan los ácidos grasos a través de la oxidación β³, regulan la homeostasis del calcio⁴ y el hierro⁵, controlan la muerte celular por apoptosis⁶ y generan especies reactivas de oxígeno (ROS), que desempeñan un papel vital en la homeostasis redox⁷. Dos procesos complementarios y opuestos mantienen la integridad y la función propia de las mitocondrias: la síntesis de nuevos componentes mitocondriales (biogénesis) y la eliminación selectiva de los dañados a través de la autofagia mitocondrial (es decir, mitofagia)⁸.

Varias vías de mitofagia están mediadas por enzimas, como PINK1/Parkin, y receptores, incluyendo FUNDC1, FKBP8 y BNIP/NIX ^9,10. En particular, la degradación selectiva de los componentes mitocondriales puede ocurrir independientemente de la maquinaria del autofagosoma (es decir, a través de vesículas derivadas de mitocondrias)¹¹. Sin embargo, los criterios de valoración de las diferentes vías de mitofagia selectiva son similares (es decir, degradación mitocondrial por enzimas lisosomales)^12,13. Por esta razón, varios métodos para identificar y medir la mitofagia se basan en la colocalización de marcadores mitocondriales y lisosomales 14,15,16,17 y la disminución de los niveles de proteínas mitocondriales/ADN mitocondrial ¹⁸.

A continuación se muestra una descripción concisa de las metodologías experimentales existentes para medir la mitofagia en células animales utilizando microscopía de fluorescencia, enfatizando la fase de punto final de mitofagia.

Biosensores de mitofagia
La degradación mitocondrial ocurre dentro del ambiente ácido del lisosoma¹⁹. Por lo tanto, los componentes mitocondriales, incluidas las proteínas, experimentan un cambio de un pH neutro a un pH ácido en el punto final del proceso de mitofagia. Este patrón sustenta el mecanismo de acción de varios biosensores de mitofagia, incluyendo mito-Rosella¹⁸ y tándem mCherry-GFP-FIS1¹⁴. Estos sensores contienen una proteína de fluorescencia verde sensible al pH (GFP) y una proteína de fluorescencia roja (RFP) insensible al pH. Por lo tanto, en el punto final de la mitofagia, la relación de fluorescencia verde-rojo disminuye significativamente debido al enfriamiento del fluoróforo GFP. Las principales limitaciones de estos sensores son (1) posible transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) entre los fluoróforos; (2) la tasa de maduración diferencial de GFP y RFP; (3) disociación entre la GFP y la RFP debido a la escisión proteolítica del polipéptido que las conecta; (4) superposición de emisiones fluorescentes; y (5) brillo y enfriamiento diferencial del fluoróforo^15,16.

Un sensor que supera algunas de estas limitaciones es el sensor mitocondrial Keima¹⁷. El sensor mt-Keima (derivado de la proteína de coral Keima) muestra un pico de emisión único (620 nm). Sin embargo, sus picos de excitación son sensibles al pH. Como resultado, hay una transición de una excitación verde (440 nm) a una roja (586 nm) cuando se cambia de un pH alto a un pH ácido^16,17. Un sensor de mitofagia más reciente, Mito-SRAI, ha avanzado el campo al permitir mediciones en muestras biológicas fijas²⁰. Sin embargo, a pesar de las muchas ventajas de los sensores genéticos, como la capacidad de expresarlos en tejidos / células específicos y dirigirlos a distintos compartimentos mitocondriales, también tienen limitaciones. Una limitación es que los sensores genéticos deben expresarse en células o animales, lo que puede llevar mucho tiempo y consumir muchos recursos.

Además, la expresión de los sensores dentro de las propias mitocondrias puede influir en la función mitocondrial. Por ejemplo, la expresión de GFP mitocondrial (mtGFP) en los músculos de la pared corporal del gusano C. elegans expande la red mitocondrial²¹. Este fenotipo depende de la función del factor de transcripción activado por estrés ATFS-1, que desempeña un papel esencial en la activación de la respuesta proteica desplegada en mitocondrias (UPR^mt)²¹. Por lo tanto, aunque los biosensores de mitocondria/mitofagia codificados genéticamente son extremadamente útiles para monitorear la homeostasis de las mitocondrias in vivo, pueden afectar el proceso para el que están diseñados.

Anticuerpos y colorantes específicos de mitocondrias/lisosomas
Otra estrategia para probar la colocalización mitocondrial/lisosomas es usar anticuerpos contra proteínas mitocondriales/lisosomales, como la proteína mitocondrial de la membrana externa TOM20 y la proteína de membrana asociada a lisosomas 1 (LAMP1)²². En la mayoría de los casos, los anticuerpos secundarios que se conjugan a un fluoróforo se utilizan para detectar la señal de fluorescencia a través de microscopía. Otra estrategia es combinar construcciones genéticas con colorantes mitocondriales/lisosomales, como expresar una construcción de fusión LAMP1::GFP en células mientras se tiñen con un colorante mitocondrial rojo (por ejemplo, Mitotracker Red)¹⁶. Estas metodologías, aunque efectivas, requieren anticuerpos específicos y a menudo implican trabajar con especímenes fijos o generar células / animales transgénicos que expresan mitocondrias / lisosomas marcados con fluorescencia.

Aquí, describimos la utilización de un kit comercial de tinción lisosoma/mitocondria/nuclear para evaluar las propiedades activadoras de la mitofagia de la diamina sintética O,O (octano-1,8-diil)bis(hidroxilamina), en lo sucesivo denominada VL-850²³, en gusanos C. elegans y la línea celular de cáncer humano Hep-3B (Figura 1). El kit de tinción contiene una mezcla de colorantes lisosomales/mitocondriales/nucleares que tiñen específicamente estos orgánulos²³. Anteriormente utilizamos este kit para demostrar la actividad mitofagia del 1,8 diaminooctano (en adelante, VL-004) en C. elegans²³. Es importante destacar que validamos los resultados del kit de tinción con el biosensor mito-Rosella y las mediciones por qPCR del contenido de ADN mitocondrial:nuclear²³. Este kit de tinción ofrece las siguientes ventajas. En primer lugar, no hay necesidad de generar animales transgénicos o células que expresen un biosensor mitocondrial. Por lo tanto, podemos estudiar animales o células de tipo salvaje no modificados y, por lo tanto, ahorrar mucho tiempo, dinero y trabajo. Además, como se mencionó, la expresión de biosensores mitocondriales puede cambiar la función mitocondrial. En segundo lugar, el kit es rentable, fácil de usar y rápido. En tercer lugar, aunque demostramos el método en C. elegans y células humanas, podría modificarse para otros tipos de células y organismos.

Dicho esto, como cualquier método, el protocolo del kit de tinción tiene inconvenientes. Por ejemplo, la incubación de los gusanos con el reactivo se lleva a cabo en ausencia de alimentos (hemos visto que incluso las bacterias muertas disminuyen significativamente la eficiencia de tinción). Aunque el tiempo de incubación es relativamente corto, es posible que incluso en este período de tiempo, las respuestas homeostáticas puedan verse alteradas, incluida la mitofagia. Además, la unión de los colorantes a las proteínas ER/mitocondriales/nucleares y otras biomoléculas puede afectar las actividades de estos orgánulos. Además, a diferencia de la medición de mitofagia con sensores genéticos, trabajamos con gusanos y células que han sufrido fijación química. Por lo tanto, es imposible continuar monitoreando los mismos gusanos / células en diferentes momentos. Por lo tanto, recomendamos combinar diferentes metodologías para validar la función de la mitofagia en un proceso fisiológico particular. A continuación, presentamos nuevos datos que demuestran que VL-850 induce mitofagia robusta en gusanos C. elegans y células Hep-3B. Por lo tanto, estos datos apoyan aún más la hipótesis de que VL-850 extiende la vida útil de C. elegans y protege a C. elegans del daño oxidativo a través de la inducción de mitofagia sana . Hemos utilizado el ionóforo de protones cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona (FCCP), que es un potente inductor de mitofagia²⁴, como control positivo.

Protocolo

NOTA: Para la comodidad de los lectores, hemos dividido el protocolo en dos partes: una se centra en el protocolo para medir la mitofagia en C. elegans, y la otra se centra en el protocolo para medir la mitofagia en las células hepáticas. La lista de materiales se puede encontrar en la Tabla de materiales proporcionada.

1. El protocolo de C. elegans

1. Preparación de las placas del medio de crecimiento de nematodos (NGM) y la cepa bacteriana OP50 de Escherichia coli
   NOTA: Como punto de aclaración, si bien seguimos los protocolos estándar para la preparación de las placas NGM y OP50 cepas bacterianas^25,26, reconocemos que puede haber variaciones en estos protocolos entre diferentes laboratorios. Por lo tanto, hemos incluido los protocolos completos para garantizar la replicación precisa del experimento.
   1. Hacer un tampón de fosfato de potasio de 1 M, pH 6, agregando ~150 ml de 1 M K 2 HPO 4a 500 ml de solución de 1 M KH₂PO₄ hasta alcanzar el pH 6. Esterilice el tampón pasándolo a través de un filtro de vacío/sistema de almacenamiento de 0,22 μm.
   2. Hacer 0,1 M de cloruro de calcio (CaCl 2) y sulfato de magnesio (MgSO₄), y esterilizarlos con un filtro de jeringa de_0,2 μm.
   3. Preparar 5 mg/ml de colesterol en etanol absoluto.
      NOTA: Dado que el colesterol se prepara en etanol, no lo filtre.
   4. Prepare NGM-agar disolviendo 1,5 g de cloruro de sodio (NaCl), 1,25 g de peptona y 8,5 g de agar en 500 ml de agua doble destilada (DDW). Autoclave y dejar enfriar a ~55 °C.
   5. En condiciones estériles, agregue 12.5 ml de tampón fosfato de potasio (pH 6), 0.5 ml de 0.1 M CaCl₂, 0.5 ml de 0.1 M MgSO₄ y 1 ml de colesterol 5 mg / ml. Mezclar bien después de cada adición.
   6. Agregue 4 ml de agar NGM fundido a cada placa de 35 mm. Deje que los platos se solidifiquen durante la noche a temperatura ambiente (RT, ~ 21 ° C).
   7. Para hacer placas de agar Luria-Bertani (LB), disuelva 5 g de NaCl, 5 g de triptona, 2.5 g de extracto de levadura y 7.5 g de agar en 400 ml de agua destilada desionizada (DDW), ajuste el pH de la solución a 7.0, eleve el volumen hasta 500 ml con DDW y autoclave. Una vez que la solución se haya enfriado a 55 °C, vierta 25 ml de la mezcla en cada placa de Petri de 90 mm y deje que las placas se sequen durante 2 días a temperatura ambiente. A continuación, extraiga las bacterias OP50 en las placas secas de LB de la cepa de glicerol e incube a 37 ° C durante la noche para obtener colonias individuales.
   8. Preparar 2x triptona de levadura (YT) disolviendo 8 g de triptona, 5 g de extracto de levadura y 2,5 g de cloruro de sodio (NaCl) en 0,5 L de DDW. Ajuste el pH a 7 y autoclave.
   9. Al enfriar, inocular una colonia de bacterias OP50 de la placa LB recién rayada en 50 ml de medio 2x YT en un erlenmeyer de 250 ml. Agitar a 37 °C y 250 rpm hasta una densidad óptica (OD₆₀₀) de aproximadamente 0,6.
2. Preparación del vehículo y placas experimentales
   1. Agregue 100 μL de bacterias OP50 al centro de cada placa de agar NGM de 35 mm. Secar durante la noche a RT (temperatura ambiente, 21 °C).
   2. Preparar VL-850 0,5 M en DMSO y diluir a 10 mM VL-850 utilizando tampón M9 (22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na₂HPO 4, 86 mM NaCl, pH 7 y1 mM MgSO ₄)²⁶. Confirme que el pH es 7.0 (si no, ajuste con HCl 0.1 M) y esterilice la solución con un filtro de jeringa de 0.22 μm. Prepare el vehículo como se describió anteriormente, pero sin el medicamento (en este caso, VL-850). Hacer 50 mM de FCCP en DMSO, diluir a 1 mM de FCCP con tampón M9 y filtrar y esterilizar la solución con un filtro de jeringa de 0,22 μm.
   3. Agregue 25 μL de vehículo (control negativo), FCCP (control positivo; 5 μM) o VL-850 (tratamiento experimental; 62.5 μM) a las placas NGM sembradas por separado en el césped bacteriano.
   4. Cubra las placas con papel de aluminio y déjelas secar a RT (temperatura ambiente, 21 °C). Use las placas después de ~16 h.
3. Obtención sincronizada de adultos jóvenes C . elegans hermafroditas
   1. Haga 1 L de tampón M9 con 22 mM KH 2 PO 4, 42 mM Na₂HPO₄ y 86 mM NaCl. Esterilizar en autoclave, y dejar enfriar. Una vez enfriado, agregue 1 ml de 1 mM MgSO₄ (0.22 μm esterilizado por filtro).
   2. Mezclar 0,8 ml de hidróxido de sodio de 2,5 N y 1 ml de una solución al 5% de hipoclorito de sodio con 2,2 ml de DDW para crear una solución de hipoclorito alcalino de 4 ml (concentración final de 0,5 N para hidróxido de sodio y 1,25% para hipoclorito de sodio).
   3. Recoja los gusanos (hermafroditas grávidos) en un tubo cónico de 15 ml lavando las placas NGM con 1 ml de tampón M9 3x para asegurarse de que todas las madres hayan sido recogidas en el tubo.
   4. Sedimentar los gusanos por centrifugación a 500 × g durante 1 min, y desechar el sobrenadante hasta que quede un volumen de 1 ml.
   5. Agregue 1 ml de solución alcalina de hipoclorito y mezcle invirtiendo el tubo 5x. Mueva suavemente el tubo durante 3 minutos para ayudar a la liberación de huevos y observe el estado de los gusanos bajo un estereoscopio de disección.
   6. Cuando aproximadamente el 50% de los gusanos estén rotos, agregue 5 ml de tampón M9 e inmediatamente sedimente los huevos centrifugando durante 1 minuto a 500 × g.
   7. Retire el sobrenadante con cuidado sin alterar el pellet. Agregue 5 ml de tampón M9 y repita el procedimiento de lavado 2x.
   8. Retire el sobrenadante hasta que queden 2 ml y gire el tubo (rotación de 360°) a 20 rpm durante ~16 h (RT, 21 °C) para obtener larvas L1 sincronizadas. Desde este tubo, tome una gota de 5 μL en un portaobjetos de vidrio, cuente el número de larvas bajo un estereoscopio, repita este paso 3x, tome un promedio de los tres conteos y estime el número de gusanos por microlitro (μL). Con base en estos cálculos, agregue ~ 200 larvas por placa NGM sembrada con bacterias OP50.
   9. Cultivar las larvas L1 a 21 °C durante ~48 h hasta la etapa adulta joven.
4. Tratamiento farmacológico y procedimiento de microscopía
   1. Coloque 100 gusanos en cada una de las placas experimentales o de control. Asegúrese de que las placas negativa, positiva y experimental contengan el vehículo, 5 μM FCCP y 62,5 μM VL-850, respectivamente. Incubar a 21 °C durante 6 h.
   2. Use 1 ml de tampón M9 para lavar los gusanos de cada placa en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. Gire el tubo brevemente (~3 s) en una minicentrífuga. A continuación, deseche el sobrenadante pipeteando suavemente el amortiguador M9 sin perturbar la bolita del gusano. Repita este paso de lavado 2 veces y luego retire suavemente el sobrenadante sin alterar el pellet de gusano.
   3. Agregue 200 μL de tampón M9, que contiene 0,1% v/v Poloxámero 188, 0,1% v/v Pluronic F127 y 2 μL del reactivo del kit de tinción, al pellet de lombriz. Deje girar la mezcla a 20 rpm (rotación de 360°) durante 1 h a RT (temperatura ambiente, 21 °C). Para proteger los tintes de la luz, cubra los tubos con papel de aluminio.
   4. Girar los gusanos suavemente, como se describe en el paso 1.3.4. Luego, retire la solución de tinción sin alterar el pellet de gusano. A continuación, lave los gusanos como se describe en el paso 1.3.2 y transfiéralos a una placa de agar NGM sembrada que contenga el tratamiento adecuado; por ejemplo, los gusanos tratados con FCCP se transfieren a una placa que contiene FCCP. Cubra las placas con papel de aluminio porque el reactivo de tinción es sensible a la luz.
      NOTA: Transferimos los gusanos a placas de cultivo que contienen bacterias y el agente de tratamiento correspondiente para minimizar el ruido de fondo debido al exceso de colorante. Por ejemplo, los gusanos tratados con FCCP se transfirieron a placas suplementadas con FCCP, y así sucesivamente.
   5. Lave los gusanos de las placas en tubos de microcentrífuga nuevos utilizando 1 ml de tampón M9; Lave los gusanos de la misma manera 2x. A continuación, fije los gusanos con formaldehído al 1% en hielo durante 30 minutos y lave los gusanos con 1 ml de tampón M9 3x para eliminar el formaldehído residual. Después de los lavados, girar los gusanos hasta convertirlos en una bolita y aspirar la cantidad máxima de sobrenadante, manteniendo el pellet de gusano intacto en 10 μL de M9.
   6. Para preparar agarosa al 2,5%, pese 0,125 g de agarosa en un tubo de ensayo de vidrio borosilicato de 10 ml, agregue 5 ml de tampón M9 y disuelva la agarosa calentando suavemente el tubo con un quemador Bunsen. Transfiera la agarosa derretida a un baño seco a 75 °C y, con una punta de 1 ml, coloque 100 μL de agarosa fundida en un vidrio de cubierta de microscopio Deckgläser (24 mm x 60 mm). Inmediatamente, coloque otro tobogán perpendicularmente sobre la gota de agarosa, formando una forma de cruz. Espere ~ 2 minutos y separe suavemente las diapositivas empujando (suavemente) el vidrio de la cubierta superior, dejando así la almohadilla de agarosa en la diapositiva de la cubierta inferior.
      NOTA: Tenga cuidado al calentar la agarosa en el tubo y asegúrese de que el tubo se mantenga alejado del cuerpo. Corte el borde de la punta de 1 ml para minimizar la coagulación de la agarosa.
   7. Transfiera los gusanos a la almohadilla de agarosa con una pipeta de vidrio Pasteur (es decir, la cantidad total en el tubo, ~ 10 μL). Retire el exceso de líquido con una mecha hecha de una toallita de laboratorio y luego cubra los gusanos con un portaobjetos de cubierta más pequeño (24 mm x 40 mm). Aplique esmalte de uñas transparente en la periferia del portaobjetos más pequeño para evitar la evaporación. Coloque la corredera en una caja oscura para protegerla de la luz.
   8. Use un microscopio confocal para obtener imágenes de los gusanos dentro de las 24 h en las longitudes de onda apropiadas (ver más abajo) usando una lente de aumento de 60x.
      1. Coloque el portaobjetos sobre la platina del microscopio.
      2. Abra el software de imágenes y haga clic con el botón derecho en el área gris del software. Adquisición abierta | Ti2 Full Pad | Adquisición de ND | LUTs haciendo clic en las opciones de la ventana emergente que surge como resultado del clic derecho.
      3. En Ti2 Full Pad, seleccione 60x.
      4. En Adquisición, seleccione Ocular DIA y enfoque los gusanos con la perilla de enfoque fino del microscopio. En Adquisición, seleccione Disco giratorio y elija la opción 16 bits - Sin agrupación. Para cada filtro de fluorescencia, ajuste el Tiempo de exposición a 500 ms y 20 ms para Brightfield. Una vez establecidos estos parámetros, seleccione Ejecutar ahora y espere a que la imagen de salida se genere como un archivo ND2.
         NOTA: El tiempo de exposición debe determinarse experimentalmente, ya que las diferentes configuraciones de imágenes tienen diferentes características. Utilice tablas de búsqueda (LUT) para examinar la intensidad de fluorescencia para cada longitud de onda.
5. Análisis de imágenes
   1. Abra las imágenes confocales (aquí, archivos ND2 de Nikon) en ImageJ²⁷ con el complemento de colocalización. Cada archivo ND contiene planos de imagen tomados en tres longitudes de onda (usando filtros DAPI, GFP/FITC [verde] y Texas Red [rojo]) y luz visible. Para acceder a estas imágenes, abra el archivo ND en el servidor ImageJ y seleccione Dividir imágenes en el cuadro de diálogo. Trabaje con imágenes de campo claro (BF), canal verde y canal rojo.
   2. Genere duplicados de estas imágenes para mantener la imagen original intacta haciendo clic en Imagen | Duplicar o usar el método abreviado de teclado Mayús + D.
   3. Para reducir el fondo, genere otro duplicado de la imagen, como se mencionó anteriormente. Resta el fondo con un radio de rodadura de 100 y selecciona la opción Crear fondo (no restar) para generar una imagen con el fondo de la imagen dada. A continuación, vaya a Proceso | Calculadora de imágenes, y reste la primera imagen duplicada de la segunda imagen duplicada. Utilice las imágenes resultantes para el análisis de colocalización.
   4. Para utilizar el plugin de colocalización, convierta las imágenes del canal verde y del canal rojo a 8 bits. Para ello, haga clic en Imagen | Tipo | 8 bits.
   5. Haga clic en Plugins | Colocalización. Para medir la colocalización de las mitocondrias y las señales de lisosomas utilizando el complemento de colocalización (ver arriba), use los siguientes parámetros: Relación = 75%, Canal rojo umbral = 80.0, Canal verde umbral = 50.0. El resultado es una imagen binaria de 8 bits que contiene puntos colocalizados y una combinación de las tres imágenes de 8 bits (verde, rojo y la imagen colocalizada) en una imagen RGB.
   6. Concéntrese en el punto en el músculo de la pared del cuerpo de la cabeza de los gusanos seleccionando manualmente esta área y creando una máscara haciendo clic en Editar | Selección | Crear máscara, que selecciona la región de interés (Figura 2A, B). Elimine selectivamente otras entidades teñidas (por ejemplo, los músculos faríngeos) para analizar la región muscular de la pared corporal de la cabeza.
   7. Para seleccionar las partículas en la región de interés (ROI), seleccione las imágenes colocalizadas de 8 bits y enmascare utilizando la calculadora de imágenes. A continuación, utilice la operación Y (Figura 3A) para seleccionar los puntos en el ROI. Esto genera una imagen con puntcta en el ROI (Figura 3B).
   8. Para analizar el área de las mitocondrias y lisosomas colocalizados, seleccione Analizar | Analizar partículas, y medir la suma de los puntos entre 0,1625 μm 2 y 4 μm².

2. El protocolo de células cancerosas Hep-3B

1. Preparación de la solución madre de medicamentos.
   1. Prepare 100 mM VL-850 en DMSO. Diluirlo a 5 mM con tampón HEPES 0,5 M, pH 7,3, y esterilizar la solución utilizando un filtro de jeringa de 0,22 μm. Luego, prepare el vehículo como se describió anteriormente, pero sin el medicamento (en este caso, VL-850).
2. Cultivo de células Hep-3B para el experimento, tratamiento farmacológico y procedimiento de microscopía
   1. Cultivar células Hep-3B en placas de cultivo de tejido de 10 cm que contengan el medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS), 2% de L-glutamina y 1% de tetraciclina (en adelante, DMEM completo). Incubar las células a 37 °C y 5% de_CO2.
   2. Elija una placa de células Hep-3B que muestren una confluencia celular del 70% al 80% (fase de crecimiento logarítmico), retire el medio y lave la placa con 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) precalentada. Retire el PBS e incube las células con 1 ml de tripsina al 0,25% precalentada/EDTA al 0,02% durante ~3 min a 37 °C; Observe las células bajo un microscopio de cultivo de tejidos (10x). Detenga la digestión de tripsina cuando las células se vuelvan redondas y comience a disociarse de la placa agregando 5 ml de DMEM completo. Centrifugar las células a 1.000 × g durante 5 min, retirar el sobrenadante y resuspender las células en 5 ml de DMEM completo.
   3. Determinar la concentración celular. Mezclar 50 μL de la suspensión celular con 50 μL de azul de tripano. Cuente las células usando un contador celular automatizado o usando un hemocitómetro 5x, y tome un promedio de estos recuentos para garantizar la precisión de los recuentos.
   4. Semilla 42,000 células Hep3G en cada μ portaobjetos de 8 pocillos en 400 μL de DMEM completo (como se describió anteriormente). Incubar las células durante 24 h a 37 °C y 5% de_CO2.
   5. Después de 24 h a ~80%-85% de confluencia, retire 250 μL de medio de cada uno de los pocillos y agregue 50 μL de medio con el tratamiento o vehículo apropiado. Para seguir este protocolo, trate las células con 100 μM VL-850, 5 μM FCCP y un vehículo como control.
   6. Después de la incubación de 6 h con los compuestos, añadir 50 μL de medio a cada pocillo que contenga el reactivo de tinción (0,5 μL de colorante por 250 μL en cada pocillo). Incubar las células con el colorante durante 30 min a 37 °C y 5% de_CO2.
      NOTA: Como el reactivo de tinción es sensible a la luz, minimice la exposición a la luz cubriendo las muestras con papel de aluminio y trabajando en un ambiente con poca luz (si es posible).
   7. Con una pipeta de 200 μL, retire suavemente todo el medio (250 μL) de cada pocillo y, a continuación, lave las células con 200 μL de PBS precalentado.
   8. Fijar las células con 200 μL de solución fijadora que contiene 4% de formaldehído y 2,5% de glutaraldehído preparado en PBS durante 15 min a RT.
   9. Decantar la solución fijadora y lavar brevemente con 200 μL de PBS.
   10. Añadir 200 μL de PBS, mantener las células cubiertas y protegidas de la luz a 4 °C, y la imagen en un plazo de 24 h.
       NOTA: Utilizamos el microscopio confocal de disco giratorio en cuatro canales, incluidos DIC, TRITC, FITC y DAPI, como en el paso 1.4.8. Tomamos imágenes de ~ 300 células por tratamiento.
3. Análisis de imágenes
   1. Realice los pasos 1.5.1-1.5.5. Para obtener el ROI de las células, genere una imagen que resalte el área de las células. Para ello, elija una imagen de puntos colocalizados (RGB) (Figura 4A). Para seleccionar toda el área de celda, seleccione Proceso | Binario | Crear máscara para obtener una imagen binaria (Figura 4B). Para analizar el área de la celda, seleccione Analizar | Analizar partículas y medir todas las partículas de la imagen de 0 a infinito, que es la configuración predeterminada para Analizar partículas.
   2. Para analizar el área de las mitocondrias y lisosomas colocalizados, seleccione una imagen colocalizada de 8 bits, conviértala en binaria seleccionando seleccionar Proceso | Binario | Crear binario, seleccione Analizar | Analizar partículas, y medir la suma de puntos entre 0,1625 μm 2 y 4 μm². Para medir el punto colocalizado, divida el área de las mitocondrias y lisosomas colocalizados por el área celular total.

Resultados

Inducción de una respuesta mitofagia robusta tanto en gusanos C. elegans como en células Hep-3B con VL-850
VL-850 protege a los gusanos C. elegans y queratinocitos humanos (células HaCaT) del estrés oxidativo²³. Para explorar más a fondo su mecanismo de acción, examinamos si VL-850 induce mitofagia en C. elegans y otras células humanas. Para probar esto, expusimos gusanos C. elegans (adultos jóvenes, 3 días después de L1) a 62.5 μM...

Discusión

Múltiples vías de mitofagia involucran varias proteínas y biomoléculas (por ejemplo, cardiolipina²⁹). Sin embargo, el punto final de estas vías es similar: la degradación de las mitocondrias por enzimas lisosomales^12,13. De hecho, varios métodos utilizan este criterio de valoración para cuantificar la mitofagia. Sin embargo, algunos métodos, como la microscopía electrónica, requieren acceso a equipos costosos, expertos capacitad...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent or resource
Analytical balance	Mettler-Toledo
Bacto Agar	BD-Difco	214010
Bacto Peptone	BD-Difco	211677
Bacto Tryptone	BD-Difco	211705
Bacto Yeast extract	BD-Difco	212750
Calcium chloride	Sigma	C1016
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)	Sigma	C2920
Chemicals
Cholestrol	Thermo Fisher	C/5360/48
DMEM high glucose	Biological Industries	01-055-1A
Double distilled water (DDW)
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biological Industries	02-023-1A
FBS heat inactivated	Invitrogen	M7514
Gluteradehyde (25%)	Sigma	G5882
HEPES Buffer 1 M	Biological Industries	03-025-1B
L-gluatamine	Biological Industries	03-020-1B
Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent	Abcam	ab139487
Magnesium Sulfate	Sigma	M7506
Nonidet P 40	Sigma	74385
Paraformalydehyde (16%)	Electron Microscopy Sciences	15720
Poloxamer 188 Solution	Sigma	P5556
Potassium dihydrogen phosphate	Millipore	1.04873.1000
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P3786
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
Sodium Chloride	Bio-Lab	1903059100
Sodium Hydroxide	Gadot	1310732
Sodium phosphate dibasic dodecahydrate	Sigma	4273
Tetracycline hydrochloride	Sigma	87128-25G
Trypsin-EDTA	Biological Industries	03-052-1A
VL-850: 1,8-diaminooxy-octane	Patented
Glass/Plastic Disposables
0.22 μm syringe filter	Millex GV	SLGV033RS
1.7 mL Micro Centrifuge Tubes	Lifegene	LMCT1.7B-500
10 cm Petri plates	Corning	430167
1,000 mL Erlenmeyer Flask	IsoLab, Germany
15 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB15-500
35 mm Petri dishes	Bar Naor	BN9015810
500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm	Lifegene	LG-FPE205500S
50 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB50-500
Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm	Marienfeld	101152
Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass	Pyrex	99445-13
iBiDi 8 well μ-slides	iBiDi	80826
Microscope cover glass 24 x 40 mm	Bar Naor	BN1052421ECALN
Platinum iridium 0.25 mM wire	World Precision Instruments	PT1002
Instruments
Cell counter CellDrop BF	DeNovix	CellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400	Biosan	BS-010201-AAA
Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software	Nikon	CSU-W1
Olympus SZ61 stereo microscope	Olympus	SZ61
pH meter	Mettler-Toledo	MT30019032
Revolver Adjustable Lab Rotator	Labnet	H5600