Detección de mitofagia en Caenorhabditis elegans y células de mamíferos utilizando colorantes específicos de orgánulos

Resumen

Explorar la mitofagia a través de microscopía electrónica, sensores genéticos e inmunofluorescencia requiere equipos costosos, personal calificado y una inversión de tiempo significativa. Aquí, demostramos la eficacia de un kit de colorante de fluorescencia comercial para cuantificar el proceso de mitofagia tanto en Caenorhabditis elegans como en una línea celular de cáncer de hígado.

Resumen

Las mitocondrias son esenciales para diversas funciones biológicas, incluida la producción de energía, el metabolismo de los lípidos, la homeostasis del calcio, la biosíntesis del hemo, la muerte celular regulada y la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS). Las ROS son vitales para los procesos biológicos clave. Sin embargo, cuando no se controlan, pueden provocar lesiones oxidativas, incluido el daño mitocondrial. Las mitocondrias dañadas liberan más ROS, intensificando así la lesión celular y el estado de la enfermedad. Un proceso homeostático llamado autofagia mitocondrial (mitofagia) elimina selectivamente las mitocondrias dañadas, que luego son reemplazadas por otras nuevas. Existen múltiples vías de mitofagia, siendo el punto final común la descomposición de las mitocondrias dañadas en los lisosomas.

Varias metodologías, incluidos los sensores genéticos, la inmunofluorescencia de anticuerpos y la microscopía electrónica, utilizan este criterio de valoración para cuantificar la mitofagia. Cada método para examinar la mitofagia tiene sus ventajas, como la orientación específica de tejidos/células (con sensores genéticos) y gran detalle (con microscopía electrónica). Sin embargo, estos métodos a menudo requieren recursos costosos, personal capacitado y un largo tiempo de preparación antes del experimento real, como para crear animales transgénicos. Aquí, presentamos una alternativa rentable para medir la mitofagia utilizando tintes fluorescentes disponibles comercialmente dirigidos a mitocondrias y lisosomas. Este método mide eficazmente la mitofagia en el nematodo Caenorhabditis elegans y las células hepáticas humanas , lo que indica su eficiencia potencial en otros sistemas modelo.

Introducción

Las mitocondrias son esenciales para todos los animales aeróbicos, incluidos los humanos. Convierten la energía química de las biomoléculas en trifosfato de adenosina (ATP) a través de la fosforilación oxidativa¹, sintetizan hemo², degradan los ácidos grasos a través de la oxidación β³, regulan la homeostasis del calcio⁴ y el hierro⁵, controlan la muerte celular por apoptosis⁶ y generan especies reactivas de oxígeno (ROS), que desempeñan un papel vital en la homeostasis redox⁷. Dos procesos com....

Protocolo

NOTA: Para la comodidad de los lectores, hemos dividido el protocolo en dos partes: una se centra en el protocolo para medir la mitofagia en C. elegans, y la otra se centra en el protocolo para medir la mitofagia en las células hepáticas. La lista de materiales se puede encontrar en la Tabla de materiales proporcionada.

1. El protocolo de C. elegans

1. Preparación de las placas del medio de crecimiento de nematodos (NGM) y la cepa bacteriana OP50 de Escherichia coli
   NOTA: Como punto de aclaración, si bien seguimos los protocolos estándar para la preparación de las placas....

Discusión

Múltiples vías de mitofagia involucran varias proteínas y biomoléculas (por ejemplo, cardiolipina²⁹). Sin embargo, el punto final de estas vías es similar: la degradación de las mitocondrias por enzimas lisosomales^12,13. De hecho, varios métodos utilizan este criterio de valoración para cuantificar la mitofagia. Sin embargo, algunos métodos, como la microscopía electrónica, requieren acceso a equipos costosos, expertos capacitad.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent or resource
Analytical balance	Mettler-Toledo
Bacto Agar	BD-Difco	214010
Bacto Peptone	BD-Difco	211677
Bacto Tryptone	BD-Difco	211705
Bacto Yeast extract	BD-Difco	212750
Calcium chloride	Sigma	C1016
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)	Sigma	C2920
Chemicals
Cholestrol	Thermo Fisher	C/5360/48
DMEM high glucose	Biological Industries	01-055-1A
Double distilled water (DDW)
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biological Industries	02-023-1A
FBS heat inactivated	Invitrogen	M7514
Gluteradehyde (25%)	Sigma	G5882
HEPES Buffer 1 M	Biological Industries	03-025-1B
L-gluatamine	Biological Industries	03-020-1B
Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent	Abcam	ab139487
Magnesium Sulfate	Sigma	M7506
Nonidet P 40	Sigma	74385
Paraformalydehyde (16%)	Electron Microscopy Sciences	15720
Poloxamer 188 Solution	Sigma	P5556
Potassium dihydrogen phosphate	Millipore	1.04873.1000
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P3786
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
Sodium Chloride	Bio-Lab	1903059100
Sodium Hydroxide	Gadot	1310732
Sodium phosphate dibasic dodecahydrate	Sigma	4273
Tetracycline hydrochloride	Sigma	87128-25G
Trypsin-EDTA	Biological Industries	03-052-1A
VL-850: 1,8-diaminooxy-octane	Patented
Glass/Plastic Disposables
0.22 μm syringe filter	Millex GV	SLGV033RS
1.7 mL Micro Centrifuge Tubes	Lifegene	LMCT1.7B-500
10 cm Petri plates	Corning	430167
1,000 mL Erlenmeyer Flask	IsoLab, Germany
15 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB15-500
35 mm Petri dishes	Bar Naor	BN9015810
500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm	Lifegene	LG-FPE205500S
50 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB50-500
Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm	Marienfeld	101152
Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass	Pyrex	99445-13
iBiDi 8 well μ-slides	iBiDi	80826
Microscope cover glass 24 x 40 mm	Bar Naor	BN1052421ECALN
Platinum iridium 0.25 mM wire	World Precision Instruments	PT1002
Instruments
Cell counter CellDrop BF	DeNovix	CellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400	Biosan	BS-010201-AAA
Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software	Nikon	CSU-W1
Olympus SZ61 stereo microscope	Olympus	SZ61
pH meter	Mettler-Toledo	MT30019032
Revolver Adjustable Lab Rotator	Labnet	H5600