使用细胞器特异性染料检测 秀丽隐杆 线虫和哺乳动物细胞中的线粒体自噬

摘要

通过电子显微镜、基因传感器和免疫荧光探索线粒体自噬需要昂贵的设备、熟练的人员和大量的时间投资。在这里，我们证明了商业荧光染料试剂盒在量化 秀丽隐杆线虫 和肝癌细胞系的线粒体自噬过程方面的功效。

摘要

线粒体对于各种生物学功能至关重要，包括能量产生、脂质代谢、钙稳态、血红素生物合成、调节细胞死亡和活性氧 （ROS） 的产生。ROS对于关键的生物过程至关重要。然而，如果不加以控制，它们会导致氧化损伤，包括线粒体损伤。受损的线粒体释放更多的ROS，从而加剧细胞损伤和疾病状态。一种称为线粒体自噬（线粒体自噬）的稳态过程选择性地去除受损的线粒体，然后被新的线粒体取代。有多种线粒体自噬途径，共同的终点是溶酶体中受损线粒体的分解。

包括遗传传感器、抗体免疫荧光和电子显微镜在内的几种方法使用该终点来量化线粒体自噬。每种检查线粒体自噬的方法都有其优点，例如特定的组织/细胞靶向（使用遗传传感器）和出色的细节（使用电子显微镜）。然而，这些方法通常需要昂贵的资源，训练有素的人员，以及在实际实验之前漫长的准备时间，例如用于创造转基因动物。在这里，我们提出了一种具有成本效益的替代方案，用于使用靶向线粒体和溶酶体的市售荧光染料测量线粒体自噬。该方法有效地测量线虫秀 丽隐杆 线虫和人肝细胞中的线粒体自噬，这表明其在其他模型系统中的潜在效率。

引言

线粒体对所有有氧动物（包括人类）都是必不可少的。它们通过氧化磷酸化1将生物分子的化学能转化为三磷酸腺苷（ATP），合成血红素²，通过β氧化降解^{脂肪酸3，}调节钙⁴和铁⁵稳态，通过细胞凋亡控制细胞死亡⁶，并产生活性氧（ROS），在氧化还原稳态中起至关重要的作用⁷.两个互补和相反的过程保持线粒体的完整性和正常功能：新线粒体成分的合成（生物发生）和通过线粒体自噬选择性去除受损成分（即线粒体自噬）⁸。

几种线粒体自噬途径由酶介导，例如PINK1 / Parkin和受体，包括FUNDC1，FKBP8和BNIP / NIX^9，10。值得注意的是，线粒体成分的选择性降解可以独立于自噬体机制（即，通过线粒体衍生的囊泡）发生¹¹。然而，不同选择性线粒体自噬途径的终点是相似的（即溶酶体酶的线粒体降解）^12....

研究方案

注意：为了方便读者，我们将协议分为两部分：一部分侧重于测量 秀丽隐杆线虫线粒体自噬的协议，另一部分侧重于测量肝细胞线粒体自噬的协议。材料清单可以在提供 的材料表 中找到。

1. 秀丽隐杆线虫 协议

1. 制备线虫生长培养基（NGM）板和 大肠杆菌 OP50细菌原液
   注意：作为澄清，虽然我们遵循了制备NGM板和OP50细菌储备^液25，²⁶的标准方案^，但我们认识到不同实验室之间的这些方案可能存在差异。因此，我们包含了完整的实验方案，以确保实验的准确复制。
   1. 加入 ~150 mL 的 1 M K 2 HPO 4 至 500 mL 的 1 M KH₂PO₄ 溶液，直至达到 pH 6，制成 pH 6 M 磷酸钾缓冲液。通过0.22μm真空过滤器/存储系统对缓冲液进行灭菌。
   2. 制作0.1M氯化钙（CaCl₂）和硫酸镁（MgSO₄），并用0.2μm注射器过滤器对其进行灭菌。
   3. 在无水乙醇中制备5毫克/毫升胆固醇。
      注意：由于胆固醇是在乙醇中制备的，....

讨论

多种线粒体自噬途径涉及各种蛋白质和生物分子（例如心磷脂²⁹）。然而，这些途径的终点是相似的——溶酶体酶^12，13对线粒体的降解。事实上，有几种方法使用这个端点来量化线粒体自噬。然而，一些方法，如电子显微镜，需要昂贵的设备、训练有素的专家，以及延长标本和分析的准备时间。此外，尽管使用线粒体自噬生物传感器?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent or resource
Analytical balance	Mettler-Toledo
Bacto Agar	BD-Difco	214010
Bacto Peptone	BD-Difco	211677
Bacto Tryptone	BD-Difco	211705
Bacto Yeast extract	BD-Difco	212750
Calcium chloride	Sigma	C1016
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)	Sigma	C2920
Chemicals
Cholestrol	Thermo Fisher	C/5360/48
DMEM high glucose	Biological Industries	01-055-1A
Double distilled water (DDW)
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biological Industries	02-023-1A
FBS heat inactivated	Invitrogen	M7514
Gluteradehyde (25%)	Sigma	G5882
HEPES Buffer 1 M	Biological Industries	03-025-1B
L-gluatamine	Biological Industries	03-020-1B
Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent	Abcam	ab139487
Magnesium Sulfate	Sigma	M7506
Nonidet P 40	Sigma	74385
Paraformalydehyde (16%)	Electron Microscopy Sciences	15720
Poloxamer 188 Solution	Sigma	P5556
Potassium dihydrogen phosphate	Millipore	1.04873.1000
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P3786
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
Sodium Chloride	Bio-Lab	1903059100
Sodium Hydroxide	Gadot	1310732
Sodium phosphate dibasic dodecahydrate	Sigma	4273
Tetracycline hydrochloride	Sigma	87128-25G
Trypsin-EDTA	Biological Industries	03-052-1A
VL-850: 1,8-diaminooxy-octane	Patented
Glass/Plastic Disposables
0.22 μm syringe filter	Millex GV	SLGV033RS
1.7 mL Micro Centrifuge Tubes	Lifegene	LMCT1.7B-500
10 cm Petri plates	Corning	430167
1,000 mL Erlenmeyer Flask	IsoLab, Germany
15 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB15-500
35 mm Petri dishes	Bar Naor	BN9015810
500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm	Lifegene	LG-FPE205500S
50 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB50-500
Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm	Marienfeld	101152
Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass	Pyrex	99445-13
iBiDi 8 well μ-slides	iBiDi	80826
Microscope cover glass 24 x 40 mm	Bar Naor	BN1052421ECALN
Platinum iridium 0.25 mM wire	World Precision Instruments	PT1002
Instruments
Cell counter CellDrop BF	DeNovix	CellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400	Biosan	BS-010201-AAA
Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software	Nikon	CSU-W1
Olympus SZ61 stereo microscope	Olympus	SZ61
pH meter	Mettler-Toledo	MT30019032
Revolver Adjustable Lab Rotator	Labnet	H5600