A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

مواقع ملامسة الميتوكوندريا هي مجمعات بروتينية تتفاعل مع بروتينات الغشاء الداخلي والخارجي للميتوكوندريا. هذه المواقع ضرورية للتواصل بين أغشية الميتوكوندريا ، وبالتالي بين السيتوسول ومصفوفة الميتوكوندريا. نصف هنا طريقة لتحديد المرشحين المؤهلين لهذه الفئة المحددة من البروتينات.

Abstract

توجد الميتوكوندريا في جميع الخلايا حقيقية النواة تقريبا وتؤدي وظائف أساسية تتجاوز إنتاج الطاقة ، على سبيل المثال ، تخليق مجموعات الحديد والكبريت أو الدهون أو البروتينات ، والتخزين المؤقت Ca2+ ، وتحريض موت الخلايا المبرمج. وبالمثل ، يؤدي خلل الميتوكوندريا إلى أمراض بشرية حادة مثل السرطان والسكري والتنكس العصبي. من أجل أداء هذه الوظائف ، يجب على الميتوكوندريا التواصل مع بقية الخلية عبر غلافها ، والذي يتكون من غشاءين. لذلك ، يجب أن يتفاعل هذان الغشاءان باستمرار. مواقع الاتصال البروتينية بين الأغشية الداخلية والخارجية للميتوكوندريا ضرورية في هذا الصدد. حتى الآن ، تم تحديد العديد من مواقع الاتصال. في الطريقة الموضحة هنا ، تستخدم Saccharomyces cerevisiae mitochondria لعزل مواقع الاتصال ، وبالتالي تحديد المرشحين المؤهلين للحصول على بروتينات موقع الاتصال. استخدمنا هذه الطريقة لتحديد موقع ملامسة الميتوكوندريا ومجمع نظام تنظيم cristae (MICOS) ، وهو أحد مجمعات تكوين موقع التلامس الرئيسية في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا ، والذي يتم حفظه من الخميرة إلى البشر. في الآونة الأخيرة ، قمنا بتحسين هذه الطريقة لتحديد موقع اتصال جديد يتكون من Cqd1 ومجمع Por1-Om14.

Introduction

تؤدي الميتوكوندريا مجموعة متنوعة من الوظائف المختلفة في حقيقيات النوى، وأكثرها شهرة إنتاج الأدينوسين الثلاثي الفوسفات (ATP) من خلال الفسفرة التأكسدية. تشمل الوظائف الأخرى إنتاج مجموعات الحديد والكبريت ، وتخليق الدهون ، وفي حقيقيات النوى العليا ، وإشارات Ca2+ ، وتحريض موت الخلايا المبرمج1،2،3،4. ترتبط هذه الوظائف ارتباطا لا ينفصم ببنيتها الفائقة المعقدة.

تم وصف البنية الفوقية للميتوكوندريا لأول مرة بواسطة المجهر الإلكتروني5. وقد تبين أن الميتوكوندريا هي عضيات معقدة إلى حد ما تتكون....

Protocol

1. المخازن المؤقتة وحلول المخزون

  1. اصنع محلول 1 M 3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS) في الماء منزوع الأيونات ، درجة الحموضة 7.4. يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية.
  2. تحضير 500 mM حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) في الماء منزوع الأيونات ، درجة الحموضة 8.0. يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
  3. تحضير 2.4 متر السوربيتول في الماء منزوع الأيونات. تخزينها في درجة حرارة الغرفة بعد التعقيم.
  4. تحضير 2.5 متر السكروز في الماء منزوع الأيونات. تخزينها في درجة حرارة الغرفة بعد التعقيم.
  5. تحضير 200 mM فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF) في الأيزوبروبانول. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
    تنبيه: PMSF سام إذا تم ابتلاعه ويسبب....

النتائج

من السهل نسبيا فصل الأغشية الداخلية والخارجية للميتوكوندريا. ومع ذلك ، فإن توليد وفصل الحويصلات المحتوية على موقع الاتصال أكثر صعوبة. في رأينا ، هناك خطوتان حاسمتان وضروريتان: شروط الصوتنة والتدرج المستخدم.

عادة ، يعتقد أن التدرجات الخطية لها دقة أفضل مقارنة بتدرجات الخطو?.......

Discussion

تجزئة الميتوكوندريا هي تجربة معقدة مع عدة خطوات معقدة للغاية. لذلك ، كنا نهدف إلى زيادة تحسين ، وإلى حد ما ، تبسيط طريقتنا32 المعمول بها. هنا ، كانت التحديات هي الحاجة إلى معدات معقدة ومتخصصة للغاية ، والتي غالبا ما تكون إنشاءات فردية ، والوقت الهائل واستهلاك الطاقة. تحقيقا لهذ?.......

Disclosures

يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تعترف M.E.H. بالدعم المالي للمؤسسة الألمانية (DFG) ، المشروع رقم 413985647. يشكر المؤلفون الدكتور مايكل كيبلر ، جامعة لودفيغ ماكسيميليان ، ميونيخ ، على دعمه السخي والواسع. نحن ممتنون لوالتر نيوبرت على مدخلاته العلمية ومناقشاته المفيدة وإلهامه المستمر. JF يشكر كلية الدراسات العليا لعلوم الحياة في ميونيخ (LSM) على الدعم.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mmBeckman Instruments, Germany344059
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mmBeckman Instruments, Germany363647
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x gBeckman Instruments, Germany363055
Abbe refractometerZeiss, Germanydiscontinued,
any pipet controller will suffice
accu-jet pro Pipet ControllerBrandtech, USABR26320discontinued,
any pipet controller will suffice
Beaker 1000 mLDWK Life Science, GermanyC118.1
Branson  Digital Sonifier W-250 DBranson Ultrasonics, USAFIS15-338-125
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIPBranson Ultrasonics, USA101-148-062
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling CellBranson Ultrasonics, USA15-338-70
Centrifuge Avanti JXN-26Beckman Instruments, GermanyB37912
Centrifuge Optima XPN-100 ultraBeckman Instruments, Germany8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-CocktailRoche, Switzerland11697498001
D-SorbitRoth, Germany6213
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate)Roth, Germany8043
Erlenmeyer flask, 100 mLRoth, GermanyX747.1
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1Hirschmann, Germany1180170
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05Hirschmann, Germany1180153
ice bathneoLab, Germany S12651
Magnetic stirrer RCT basicIKA-Werke GmbH, GermanyZ645060GB-1EA
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid)Gerbu, Germany1081
MyPipetman Select P1000Gilson, USAFP10006S
MyPipetman Select P20Gilson, USAFP10003S
MyPipetman Select P200Gilson, USAFP10005S
Omnifix 1 mLBraun, Germany4022495251879
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Serva, Germany32395.03
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mmBraun, Germany4022495052414
stirring bar, 15 mmVWR, USA442-0366
SucroseMerck, GermanyS8501
SW 41 Ti Swinging-Bucket RotorBeckman Instruments, Germany331362
Test tubesEppendorf, Germany3810X
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vesselVWR, USA432-0200
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tipVWR, USA432-0212
Trichloroacetic acid (TCA)Sigma Aldrich, Germany33731discontinued,
any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)
TRISRoth, Germany4855

References

  1. Braymer, J. J., Freibert, S. A., Rakwalska-bange, M., Lill, R. BBA - Molecular Cell Research Mechanistic concepts of iron-sulfur protein biogenesis in Biology * General concepts of FeS protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1868 (1), 118863 (2021).
  2. Osman, C., Merkwirth, C., Langer, T.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Ca2 Saccharomyces Cerevisiae Mitochondria Cristae MICOS Cqd1 Por1 OM14

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved