A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
مواقع ملامسة الميتوكوندريا هي مجمعات بروتينية تتفاعل مع بروتينات الغشاء الداخلي والخارجي للميتوكوندريا. هذه المواقع ضرورية للتواصل بين أغشية الميتوكوندريا ، وبالتالي بين السيتوسول ومصفوفة الميتوكوندريا. نصف هنا طريقة لتحديد المرشحين المؤهلين لهذه الفئة المحددة من البروتينات.
توجد الميتوكوندريا في جميع الخلايا حقيقية النواة تقريبا وتؤدي وظائف أساسية تتجاوز إنتاج الطاقة ، على سبيل المثال ، تخليق مجموعات الحديد والكبريت أو الدهون أو البروتينات ، والتخزين المؤقت Ca2+ ، وتحريض موت الخلايا المبرمج. وبالمثل ، يؤدي خلل الميتوكوندريا إلى أمراض بشرية حادة مثل السرطان والسكري والتنكس العصبي. من أجل أداء هذه الوظائف ، يجب على الميتوكوندريا التواصل مع بقية الخلية عبر غلافها ، والذي يتكون من غشاءين. لذلك ، يجب أن يتفاعل هذان الغشاءان باستمرار. مواقع الاتصال البروتينية بين الأغشية الداخلية والخارجية للميتوكوندريا ضرورية في هذا الصدد. حتى الآن ، تم تحديد العديد من مواقع الاتصال. في الطريقة الموضحة هنا ، تستخدم Saccharomyces cerevisiae mitochondria لعزل مواقع الاتصال ، وبالتالي تحديد المرشحين المؤهلين للحصول على بروتينات موقع الاتصال. استخدمنا هذه الطريقة لتحديد موقع ملامسة الميتوكوندريا ومجمع نظام تنظيم cristae (MICOS) ، وهو أحد مجمعات تكوين موقع التلامس الرئيسية في الغشاء الداخلي للميتوكوندريا ، والذي يتم حفظه من الخميرة إلى البشر. في الآونة الأخيرة ، قمنا بتحسين هذه الطريقة لتحديد موقع اتصال جديد يتكون من Cqd1 ومجمع Por1-Om14.
تؤدي الميتوكوندريا مجموعة متنوعة من الوظائف المختلفة في حقيقيات النوى، وأكثرها شهرة إنتاج الأدينوسين الثلاثي الفوسفات (ATP) من خلال الفسفرة التأكسدية. تشمل الوظائف الأخرى إنتاج مجموعات الحديد والكبريت ، وتخليق الدهون ، وفي حقيقيات النوى العليا ، وإشارات Ca2+ ، وتحريض موت الخلايا المبرمج1،2،3،4. ترتبط هذه الوظائف ارتباطا لا ينفصم ببنيتها الفائقة المعقدة.
تم وصف البنية الفوقية للميتوكوندريا لأول مرة بواسطة المجهر الإلكتروني5. وقد تبين أن الميتوكوندريا هي عضيات معقدة إلى حد ما تتكون....
1. المخازن المؤقتة وحلول المخزون
من السهل نسبيا فصل الأغشية الداخلية والخارجية للميتوكوندريا. ومع ذلك ، فإن توليد وفصل الحويصلات المحتوية على موقع الاتصال أكثر صعوبة. في رأينا ، هناك خطوتان حاسمتان وضروريتان: شروط الصوتنة والتدرج المستخدم.
عادة ، يعتقد أن التدرجات الخطية لها دقة أفضل مقارنة بتدرجات الخطو?.......
تجزئة الميتوكوندريا هي تجربة معقدة مع عدة خطوات معقدة للغاية. لذلك ، كنا نهدف إلى زيادة تحسين ، وإلى حد ما ، تبسيط طريقتنا32 المعمول بها. هنا ، كانت التحديات هي الحاجة إلى معدات معقدة ومتخصصة للغاية ، والتي غالبا ما تكون إنشاءات فردية ، والوقت الهائل واستهلاك الطاقة. تحقيقا لهذ?.......
يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح.
تعترف M.E.H. بالدعم المالي للمؤسسة الألمانية (DFG) ، المشروع رقم 413985647. يشكر المؤلفون الدكتور مايكل كيبلر ، جامعة لودفيغ ماكسيميليان ، ميونيخ ، على دعمه السخي والواسع. نحن ممتنون لوالتر نيوبرت على مدخلاته العلمية ومناقشاته المفيدة وإلهامه المستمر. JF يشكر كلية الدراسات العليا لعلوم الحياة في ميونيخ (LSM) على الدعم.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm | Beckman Instruments, Germany | 344059 | |
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm | Beckman Instruments, Germany | 363647 | |
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g | Beckman Instruments, Germany | 363055 | |
Abbe refractometer | Zeiss, Germany | discontinued, any pipet controller will suffice | |
accu-jet pro Pipet Controller | Brandtech, USA | BR26320 | discontinued, any pipet controller will suffice |
Beaker 1000 mL | DWK Life Science, Germany | C118.1 | |
Branson Digital Sonifier W-250 D | Branson Ultrasonics, USA | FIS15-338-125 | |
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP | Branson Ultrasonics, USA | 101-148-062 | |
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell | Branson Ultrasonics, USA | 15-338-70 | |
Centrifuge Avanti JXN-26 | Beckman Instruments, Germany | B37912 | |
Centrifuge Optima XPN-100 ultra | Beckman Instruments, Germany | 8043-30-0031 | |
cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail | Roche, Switzerland | 11697498001 | |
D-Sorbit | Roth, Germany | 6213 | |
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Roth, Germany | 8043 | |
Erlenmeyer flask, 100 mL | Roth, Germany | X747.1 | |
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1 | Hirschmann, Germany | 1180170 | |
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05 | Hirschmann, Germany | 1180153 | |
ice bath | neoLab, Germany | S12651 | |
Magnetic stirrer RCT basic | IKA-Werke GmbH, Germany | Z645060GB-1EA | |
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid) | Gerbu, Germany | 1081 | |
MyPipetman Select P1000 | Gilson, USA | FP10006S | |
MyPipetman Select P20 | Gilson, USA | FP10003S | |
MyPipetman Select P200 | Gilson, USA | FP10005S | |
Omnifix 1 mL | Braun, Germany | 4022495251879 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Serva, Germany | 32395.03 | |
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm | Braun, Germany | 4022495052414 | |
stirring bar, 15 mm | VWR, USA | 442-0366 | |
Sucrose | Merck, Germany | S8501 | |
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Instruments, Germany | 331362 | |
Test tubes | Eppendorf, Germany | 3810X | |
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel | VWR, USA | 432-0200 | |
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip | VWR, USA | 432-0212 | |
Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma Aldrich, Germany | 33731 | discontinued, any TCA will suffice (CAS: 73-03-9) |
TRIS | Roth, Germany | 4855 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved