ミトコンドリア接触部位を単離するための改良された方法

要約

ミトコンドリアコンタクトサイトは、ミトコンドリアの内膜および外膜タンパク質と相互作用するタンパク質複合体です。これらの部位は、ミトコンドリア膜間のコミュニケーション、したがって細胞質とミトコンドリアマトリックスの間のコミュニケーションに不可欠です。ここでは、この特定のクラスのタンパク質に適格な候補を同定する方法について説明します。

要約

ミトコンドリアは、事実上すべての真核細胞に存在し、例えば、鉄硫黄クラスター、脂質、またはタンパク質の合成、Ca²⁺ 緩衝、およびアポトーシスの誘導など、エネルギー生産をはるかに超える重要な機能を果たします。同様に、ミトコンドリアの機能不全は、癌、糖尿病、神経変性などの重篤な人間の病気を引き起こします。これらの機能を実行するために、ミトコンドリアは、2つの膜からなるエンベロープを介して細胞の残りの部分と通信する必要があります。したがって、これら2つの膜は常に相互作用する必要があります。ミトコンドリアの内膜と外膜の間のタンパク質接触部位は、この点で不可欠です。これまでのところ、いくつかの接触サイトが特定されています。本明細書に記載の方法では、 出芽酵母ミトコンドリア(Saccharomyces cerevisiae mitochondria)を用いて接触部位を単離し、したがって、接触部位タンパク質に適格な候補を同定する。この手法を用いて、酵母からヒトまで保存されているミトコンドリア内膜における主要なコンタクトサイト形成複合体の1つであるミトコンドリアコンタクトサイトとクリステ組織システム(MICOS)複合体を同定しました。最近では、この手法をさらに改良し、Cqd1とPor1-Om14複合体からなる新規コンタクトサイトを同定しました。

概要

ミトコンドリアは真核生物においてさまざまな機能を果たしており、最もよく知られているのは酸化的リン酸化によるATPの産生です。その他の機能には、鉄-硫黄クラスターの生成、脂質合成、および高等真核生物では^Ca2+シグナル伝達、およびアポ^{トーシスの}誘導が含まれます1,2,3,4。これらの機能は、その複雑な超微細構造と不可分に結びついています。

ミトコンドリアの超微細構造は、電子^{顕微鏡5によって}最初に記述された。ミトコンドリアは、ミトコンドリア外膜とミトコンドリア内膜の2つの膜からなるかなり複雑な細胞小器官であることが示されました。したがって、2つの水性区画がこれらの膜によって形成される:膜間空間およびマトリックス。ミトコンドリアの内膜は、さらに異なるセクションに分けることができます。内側の境界膜は外側の膜に近接しており、クリステは陥入を形成します。いわゆるクリスタ接合部は、内側の境界膜とクリステをつなぎます(図1)。さらに、浸透圧的に縮小したミトコンドリアの電子顕微鏡写真は、ミトコンドリア膜が緊密に結合している部位が存在することを明らかにした^6,7。これらのいわゆるコンタクトサイトは、2つの膜にまたがるタンパク質複合体によって形成されます(図1)。これらの相互作用部位は、ミトコンドリアの動態と遺伝の調節、ならびに細胞質とマトリックスの間の代謝産物とシグナルの伝達にとって重要であるため、細胞の生存に不可欠である^{と考えられている8。}

ミトコンドリア内膜のMICOS複合体は、おそらく最もよく特徴付けられ、最も用途の広いコンタクトサイト形成複合体です。MICOSは2011年に酵母で記載され、Mic60、Mic27、Mic26、Mic19、Mic12、Mic10の6つの^{サブユニット9,10,1}で構成されています。これらは約1.5MDaの複合体を形成し、クリスタ接合^部9,10,11に局在する。Mic10またはMic60のいずれかのコアサブユニットが欠失すると、この複合体が欠損する^9,11ため、これら2つのサブユニット^がMICOSの安定性に不可欠である。興味深いことに、MICOSは、TOM複合体11,12、TOB/SAM複合体^{9,12,13,14,15,16}、Fzo1-Ugo1^複合体9、Por1 10、OM45 10、Miro ¹⁷など、様々なミトコンドリア外膜タンパク質および複合体と1つだけでなく複数の接触部位を形成します.このことは、MICOS複合体が、タンパク質の取り込み、リン脂質代謝、ミトコンドリアの超微細構造の生成など、様々なミトコンドリアプロセスに関与していることを強く示唆している¹⁸。後者の機能は、MIC10またはMIC60の欠失によって誘導されるMICOS複合体の欠如が、事実上完全に規則的なクリステを欠く異常なミトコンドリアの超微細構造をもたらすため、おそらくMICOSの主要な機能である。その代わりに、内界膜と接続していない内膜小胞が蓄積する^19、20。重要なことに、MICOSは酵母からヒトまで形態と機能が保存されています²¹。MICOSサブユニットの変異と重篤なヒト疾患との関連は、高等真核生物にとっての重要性も強調している^22,23。MICOSは非常に用途が広いですが、追加の接触サイトが存在する必要があります(未発表の観察に基づく)。実際、ミトコンドリア特異的リン脂質カルジオリピンの生合成に関与するミトコンドリア融合機構Mgm1-Ugo1/Fzo1^24,25,26またはMdm31-Por1など、他のいくつかの接触部位が同定されている²⁷。最近、我々はMICOSの同定に至った手法を改良し、外膜複合体Por1-Om14と形成される新規接触部位の一部としてCqd1を同定した²⁸。興味深いことに、この接触部位は、ミトコンドリア膜の恒常性、リン脂質代謝、コエンザイム^Q28,29の分布などの複数のプロセスにも関与しているようです。

ここでは、先に述べたミトコン^ドリア9,30,31,32,33の分画の変形を用いた。ミトコンドリアの浸透圧処理は、ミトコンドリア外膜の破壊とマトリックス空間の収縮をもたらし、2つの膜は接触部位でのみ近接した状態になります。これにより、ミトコンドリア外膜またはミトコンドリア内膜のみからなる、または軽度の超音波処理による両方の膜の接触部位を含む小胞の生成が可能になります。ミトコンドリア内膜はタンパク質と脂質の比率がはるかに高いため、ミトコンドリア内膜小胞はミトコンドリア外膜小胞と比較してより高い密度を示します。密度の差を利用して、スクロース浮力密度勾配遠心分離により膜小胞を分離することができます。したがって、ミトコンドリア外膜小胞は低スクロース濃度で蓄積し、ミトコンドリア内膜小胞は高スクロース濃度で濃縮されます。接触部位を含む小胞は、中程度のスクロース濃度で濃縮されます(図2)。以下のプロトコルは、以前に確立されたもの³²と比較して、より少ない専門機器、時間、およびエネルギーを必要とするこの改良された方法を詳細に説明し、可能な接触部位タンパク質の同定のための有用なツールを提供します。

プロトコル

1. バッファーとストック溶液

1. 1 M 3-モルホリノプロパン-1-スルホン酸(MOPS)溶液を脱イオン水(pH 7.4)で調製します。4°Cで保存してください。
2. 500 mM エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を脱イオン水、pH 8.0 で調製します。室温で保存してください。
3. 脱イオン水に2.4 Mソルビトールを調製します。オートクレーブ後、室温で保存してください。
4. 脱イオン水で2.5Mスクロースを調製します。オートクレーブ後、室温で保存してください。
5. イソプロパノール中に 200 mM フェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)を調製します。-20°Cで保存してください。
   注意: PMSFは飲み込むと有毒であり、重度の皮膚火傷や眼の損傷を引き起こします。ほこりを吸い込まず、保護手袋とゴーグルを着用してください。
6. 脱イオン水で72%トリクロロ酢酸(TCA)を調製します。4°Cで保存してください。
   注意: TCAは、呼吸器への刺激、重度の皮膚の火傷、および目の損傷を引き起こす可能性があります。ほこりを吸い込まず、保護手袋とゴーグルを着用してください。
7. SMバッファー(20 mM MOPSおよび0.6 Mソルビトール、pH 7.4)を調製します。
8. 膨潤バッファー(20 mM MOPS、0.5 mM EDTA、1 mM PMSF、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(pH 7.4))を調製します。
9. スクロースグラジエントバッファー(0.8 M、0.96 M、1.02 M、1.13 M、1.3 M スクロース)を 20 mM MOPS で調製し、0.5 mM EDTA、pH 7.4 で溶液を調製します。
   注:すべてのバッファーは4°Cで保存できます。ただし、真菌の増殖を防ぐために、スクロース含有バッファーを-20°Cで保存することを推奨します。プロテアーゼ阻害剤は、使用前に新たに添加する必要があります。

2. 服従軟骨小胞の生成

1. 粗酵母ミトコンドリアを確立されたプロトコルに従って新たに分離します^34,35。
   注:この実験では、ミトコンドリアを 出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)から単離しました。他の細胞小器官を欠いた勾配の純粋なミトコンドリアの生成は必要ありません。
2. 単離したばかりのミトコンドリア10 mgを1.6 mLのSMバッファー(4°C)にピペッティングで再懸濁します(図2、ステップ1)。
3. ミトコンドリア懸濁液を予冷した100 mL三角フラスコに移します。
4. 20 mLのガラスピペットを使用して、16 mLの膨潤緩衝液をゆっくりと加えます。添加中は、氷上で絶えず穏やかに攪拌します。この浸透圧処理により、マトリックス空間に水分が取り込まれます。ミトコンドリアの内膜の腫れは外膜を破壊します。ただし、両方の膜は接触部位⁹で接触したままになります(図2、ステップ2)。
5. 氷上で30分間、一定の穏やかな攪拌下でサンプルをインキュベートします。
6. 5 mLのガラスピペットを使用して、5 mLの2.5 Mショ糖溶液をゆっくりと加え、サンプル中のスクロース濃度を約0.55 Mに上げます。この浸透圧処理は、マトリックス³⁶からの水の流出をもたらす。内膜の収縮は、外膜の残留断片までの距離を最大化することを目的としています。これにより、超音波処理によって内膜と外膜の人工ハイブリッド小胞が生成される可能性が低下します(図2、ステップ3)。
7. 氷上で15分間穏やかに撹拌しながらサンプルをインキュベートします。
8. ミトコンドリアを超音波処理して、提出軟骨膜小胞を生成します(図2、ステップ4)。
   1. ミトコンドリア懸濁液を予冷したロゼットセルに移します。
   2. ミトコンドリア懸濁液を10%の振幅で30秒間超音波処理し、ロゼットセルを氷浴で冷却します。
   3. 懸濁液を氷浴で30秒間休ませます。.
   4. 手順2.8.2と手順2.8.3をさらに3回繰り返します。
      注:超音波処理条件は、使用する超音波処理装置によって異なります。個々のマシンに対して最適化が必要になります。過酷すぎる超音波処理は、ミトコンドリアの内膜と外膜からなる小胞の人工的な形成につながります。

3. 服従軟骨小胞の分離

1. 生成された小胞を、20,000 x g で4°Cで20分間遠心分離することにより、残りの無傷のミトコンドリアから分離します。 無傷のミトコンドリアはペレット化し、小胞は上清にとどまります。
2. 小胞混合物を濃縮します。
   1. 上清を新しい超遠心分離チューブに移します。
   2. 0.8 mm x 120 mmのカニューレを装備した1 mLのシリンジを使用して、チューブの底部に0.3 mLの2.5 Mショ糖溶液のクッションをロードします。
   3. 118,000 x g で4°Cで100分間遠心分離します。
      注:ここでは、最大半径153.1mmのスイングバケットローターを使用しました。遠心分離条件はローターに大きく依存し、別のローターを使用する場合は適合させる必要があります。
3. 小胞は、遠心分離後、スクロースクッションの上部にディスクとして現れます。上澄み液の約90%を捨てる。次に、ピペッティングで上下に動かし、2.5 Mスクロースを含む残りのバッファーに再懸濁することにより、濃縮小胞を回収します。懸濁液を氷冷したDounceホモジナイザーに移します。
4. ポリテトラフルオロエチレンポッターを使用して、少なくとも10回のストロークで懸濁液を均質化します。
5. スクロースグラジエントを準備します。
   1. 5 ステップ(20 mM MOPS および 0.5 mM EDTA、pH 7.4 中の 1.3 M、1.13 M、1.02 M、0.96 M、0.8 M スクロース)を含む 11 mL のステップグラジエントの場合、各層には 2.2 mL のスクロース溶液があります。
      注意: スクロース濃度を測定および調整するには、屈折計をお勧めします。ただし、必須ではありません。10 μLの緩衝液を屈折計に塗布し、それぞれの屈折率を検出します。ショ糖濃度の計算は次のとおりです。
      
      1.3333は水の屈折率を表します。0.048403は、水溶液中のモル屈折率からスクロース濃度への線形スケーリングから得られるスクロース特異的変換指数 ^である37。
   2. 遠心分離チューブに最高濃度のショ糖を加え、チューブを-20°Cに保ちます。 レイヤーが完全にフリーズするまで待ってから、次のレイヤーを適用します。最後の層が追加されるまで適宜進み、グラジエントを-20°Cで保存します。
      注:実験を開始するときは、グラジエントを融解するために、凍結グラジエントを 4 °C に移すことを忘れないでください。これには約3時間かかります。ここでの遠心分離には、容量13.2 mLのスイングバケットローターを使用しました。別のローターを使用する場合は、グラジエントステップボリュームをそれに応じて調整する必要があります。
6. 屈折計を使用してサンプルのスクロース濃度を測定します。屈折計にアクセスできない場合は、スクロース濃度が2 Mであると仮定することもできます。この想定されるスクロース濃度は、次のステップの基礎となります。
7. 適切な量の 20 mM MOPS、0.5 mM EDTA、1 mM PMSF、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(pH 7.4)を添加して、スクロース濃度を 0.6 M に調整します。スクロース濃度が測定されずに2 Mと推定される場合は、調整後に濃度が十分に低いかどうかをテストすることをお勧めします。試験管内の200 μLの0.8 Mスクロースの上に、サンプルの少量のアリコート(約50 μL)を塗布します。サンプルは 0.8 M スクロースの上に留まる必要があります。
8. サンプル(約 1 mL)をスクロースグラジエントの上にロードします(後で参照できるように 10% を保持します)。グラジエントの乱れを避けるためには、慎重なピペッティングが重要です(図2、ステップ5)。
9. 200,000 x g 、4°Cで12時間遠心分離して小胞を分離します。可能であれば、遠心分離機をゆっくりと加速および減速に設定して、グラジエントの乱れを回避します(図2、ステップ6)。
   注:ここでは、最大半径153.1mmのスイングバケットローターを使用しました。遠心分離条件はローターに大きく依存し、別のローターを使用する場合は適合させる必要があります。
10. 1 mLのピペットを使用して、上から下へのグラジエントを700 μLのフラクションで回収します。これにより、17 のフラクションが得られ、十分な分離能が得られます。

4. 服従軟骨小胞の解析

1. 各画分を2回連続して実施されたTCA沈殿³⁸に供することにより、タンパク質を濃縮し、SDS-PAGEサンプルを調製する。
   1. 200 μL の 72% TCA を個々のフラクションに加え、溶液が均一になるまで混合します。フラクションを氷上で30分間インキュベートし、沈殿したタンパク質を20,000 x g および4°Cで20分間遠心分離してペレット化します。上清を廃棄し、500 μLの28%TCA溶液を加え、よく混合し、遠心分離ステップを繰り返します。
   2. ペレットを1 mLのアセトン(-20°C)で洗浄し、20,000 x g 、4°Cで10分間遠心分離します。 上澄みを捨て、ペレットを自然乾燥させます。ペレットを60 μLのSDSサンプルバッファーに再懸濁し、サンプルを95°Cで5分間インキュベートします。
      注:最初のTCA沈殿後、特に高密度画分に大量のスクロースが残ります。これは、追加のTCA降水によって除去されます。
2. 各画分20 μLをSDS-PAGE³⁹およびイムノブロッティング^{40、41、42、43}で分析します。

結果

ミトコンドリアの内膜と外膜を分離することは比較的簡単です。しかし、接触部位を含む小胞の生成と分離ははるかに困難です。私たちの意見では、超音波処理条件と使用される勾配の2つのステップが重要かつ不可欠です。

通常、線形グラデーションは、ステップグラデーションと比較して解像度が高いと考えられています。しかし、再現性のある生産は面倒で、特別?...

ディスカッション

ミトコンドリアの分画は、いくつかの非常に複雑なステップからなる複雑な実験です。したがって、確立された方法³²をさらに改善し、ある程度簡素化することを目指しました。ここでの課題は、複雑で高度に専門化された機器が必要であり、多くの場合、個別の構造であり、膨大な時間とエネルギーを消費することでした。そのために、線状勾配の鋳造と収穫に用いたポ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm	Beckman Instruments, Germany	344059
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm	Beckman Instruments, Germany	363647
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g	Beckman Instruments, Germany	363055
Abbe refractometer	Zeiss, Germany		discontinued, any Abbe refractometer can be used
accu-jet pro Pipet Controller	Brandtech, USA	BR26320	discontinued, any pipet controller will suffice
Beaker 1000 mL	DWK Life Science, Germany	C118.1
Branson  Digital Sonifier W-250 D	Branson Ultrasonics, USA	FIS15-338-125
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP	Branson Ultrasonics, USA	101-148-062
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell	Branson Ultrasonics, USA	15-338-70
Centrifuge Avanti JXN-26	Beckman Instruments, Germany	B37912
Centrifuge Optima XPN-100 ultra	Beckman Instruments, Germany	8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail	Roche, Switzerland	11697498001
D-Sorbit	Roth, Germany	6213
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate)	Roth, Germany	8043
Erlenmeyer flask, 100 mL	Roth, Germany	X747.1
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1	Hirschmann, Germany	1180170
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05	Hirschmann, Germany	1180153
ice bath	neoLab, Germany	S12651
Magnetic stirrer RCT basic	IKA-Werke GmbH, Germany	Z645060GB-1EA
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid)	Gerbu, Germany	1081
MyPipetman Select P1000	Gilson, USA	FP10006S
MyPipetman Select P20	Gilson, USA	FP10003S
MyPipetman Select P200	Gilson, USA	FP10005S
Omnifix 1 mL	Braun, Germany	4022495251879
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Serva, Germany	32395.03
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm	Braun, Germany	4022495052414
stirring bar, 15 mm	VWR, USA	442-0366
Sucrose	Merck, Germany	S8501
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Instruments, Germany	331362
Test tubes	Eppendorf, Germany	3810X
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel	VWR, USA	432-0200
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip	VWR, USA	432-0212
Trichloroacetic acid (TCA)	Sigma Aldrich, Germany	33731	discontinued, any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)
TRIS	Roth, Germany	4855