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Os sítios de contato mitocondrial são complexos proteicos que interagem com proteínas da membrana interna e externa mitocondriais. Esses sítios são essenciais para a comunicação entre as membranas mitocondriais e, portanto, entre o citosol e a matriz mitocondrial. Aqui, descrevemos um método para identificar candidatos que se qualificam para esta classe específica de proteínas.
As mitocôndrias estão presentes em praticamente todas as células eucarióticas e desempenham funções essenciais que vão muito além da produção de energia, por exemplo, a síntese de clusters ferro-enxofre, lipídios ou proteínas, tamponamento de Ca2+ e a indução de apoptose. Da mesma forma, a disfunção mitocondrial resulta em doenças humanas graves, como câncer, diabetes e neurodegeneração. Para desempenhar essas funções, as mitocôndrias têm que se comunicar com o resto da célula através de seu envelope, que consiste em duas membranas. Portanto, essas duas membranas têm que interagir constantemente. Os sítios de contato proteico entre as membranas interna e externa mitocondrial são essenciais nesse sentido. Até o momento, vários locais de contato foram identificados. No método aqui descrito, mitocôndrias de Saccharomyces cerevisiae são usadas para isolar sítios de contato e, assim, identificar candidatos que se qualificam para proteínas de sítio de contato. Usamos este método para identificar o sítio de contato mitocondrial e o complexo do sistema organizador de cristas (MICOS), um dos principais complexos formadores de sítios de contato na membrana interna mitocondrial, que é conservado de leveduras para humanos. Recentemente, aprimoramos ainda mais este método para identificar um novo sítio de contato consistindo de Cqd1 e o complexo Por1-Om14.
As mitocôndrias desempenham uma variedade de funções diferentes em eucariotos, sendo a mais conhecida a produção de ATP através da fosforilação oxidativa. Outras funções incluem a produção de clusters ferro-enxofre, síntese lipídica e, em eucariotos superiores, sinalização de Ca2+ e indução de apoptose 1,2,3,4. Essas funções estão inseparavelmente ligadas à sua complexa ultraestrutura.
A ultraestrutura mitocondrial foi primeiramente descrita por microscopia eletrônica5. Foi demon....
1. Amortecedores e soluções de reserva
É relativamente fácil separar as membranas internas e externas mitocondriais. No entanto, a geração e separação de vesículas contendo o local de contato são muito mais difíceis. Em nossa opinião, duas etapas são críticas e essenciais: as condições de sonicação e o gradiente utilizado.
Normalmente, acredita-se que os gradientes lineares tenham uma resolução melhor em comparação com os gradientes de passos. No entanto, sua produção reprodutível é tediosa e requer equipame.......
O subfracionamento mitocondrial é um experimento complicado com várias etapas altamente complexas. Assim, buscou-se aprimorar ainda mais e, até certo ponto, simplificar nosso método estabelecido32. Aqui, os desafios foram a exigência de equipamentos complicados e altamente especializados, que muitas vezes são construções individuais, e o enorme consumo de tempo e energia. Para tanto, procurou-se remover as bombas e construções individuais utilizadas para fundição e colheita do gradient.......
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
M.E.H. reconhece a Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), projeto número 413985647, pelo apoio financeiro. Os autores agradecem ao Dr. Michael Kiebler, Ludwig-Maximilians University, Munique, por seu generoso e extenso apoio. Somos gratos a Walter Neupert por sua contribuição científica, discussões úteis e inspiração contínua. J.F. agradece à Graduate School Life Science Munich (LSM) pelo apoio.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm | Beckman Instruments, Germany | 344059 | |
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm | Beckman Instruments, Germany | 363647 | |
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g | Beckman Instruments, Germany | 363055 | |
Abbe refractometer | Zeiss, Germany | discontinued, any pipet controller will suffice | |
accu-jet pro Pipet Controller | Brandtech, USA | BR26320 | discontinued, any pipet controller will suffice |
Beaker 1000 mL | DWK Life Science, Germany | C118.1 | |
Branson Digital Sonifier W-250 D | Branson Ultrasonics, USA | FIS15-338-125 | |
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP | Branson Ultrasonics, USA | 101-148-062 | |
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell | Branson Ultrasonics, USA | 15-338-70 | |
Centrifuge Avanti JXN-26 | Beckman Instruments, Germany | B37912 | |
Centrifuge Optima XPN-100 ultra | Beckman Instruments, Germany | 8043-30-0031 | |
cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail | Roche, Switzerland | 11697498001 | |
D-Sorbit | Roth, Germany | 6213 | |
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Roth, Germany | 8043 | |
Erlenmeyer flask, 100 mL | Roth, Germany | X747.1 | |
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1 | Hirschmann, Germany | 1180170 | |
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05 | Hirschmann, Germany | 1180153 | |
ice bath | neoLab, Germany | S12651 | |
Magnetic stirrer RCT basic | IKA-Werke GmbH, Germany | Z645060GB-1EA | |
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid) | Gerbu, Germany | 1081 | |
MyPipetman Select P1000 | Gilson, USA | FP10006S | |
MyPipetman Select P20 | Gilson, USA | FP10003S | |
MyPipetman Select P200 | Gilson, USA | FP10005S | |
Omnifix 1 mL | Braun, Germany | 4022495251879 | |
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Serva, Germany | 32395.03 | |
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm | Braun, Germany | 4022495052414 | |
stirring bar, 15 mm | VWR, USA | 442-0366 | |
Sucrose | Merck, Germany | S8501 | |
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Instruments, Germany | 331362 | |
Test tubes | Eppendorf, Germany | 3810X | |
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel | VWR, USA | 432-0200 | |
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip | VWR, USA | 432-0212 | |
Trichloroacetic acid (TCA) | Sigma Aldrich, Germany | 33731 | discontinued, any TCA will suffice (CAS: 73-03-9) |
TRIS | Roth, Germany | 4855 |
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