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Resumo

Os sítios de contato mitocondrial são complexos proteicos que interagem com proteínas da membrana interna e externa mitocondriais. Esses sítios são essenciais para a comunicação entre as membranas mitocondriais e, portanto, entre o citosol e a matriz mitocondrial. Aqui, descrevemos um método para identificar candidatos que se qualificam para esta classe específica de proteínas.

Resumo

As mitocôndrias estão presentes em praticamente todas as células eucarióticas e desempenham funções essenciais que vão muito além da produção de energia, por exemplo, a síntese de clusters ferro-enxofre, lipídios ou proteínas, tamponamento de Ca2+ e a indução de apoptose. Da mesma forma, a disfunção mitocondrial resulta em doenças humanas graves, como câncer, diabetes e neurodegeneração. Para desempenhar essas funções, as mitocôndrias têm que se comunicar com o resto da célula através de seu envelope, que consiste em duas membranas. Portanto, essas duas membranas têm que interagir constantemente. Os sítios de contato proteico entre as membranas interna e externa mitocondrial são essenciais nesse sentido. Até o momento, vários locais de contato foram identificados. No método aqui descrito, mitocôndrias de Saccharomyces cerevisiae são usadas para isolar sítios de contato e, assim, identificar candidatos que se qualificam para proteínas de sítio de contato. Usamos este método para identificar o sítio de contato mitocondrial e o complexo do sistema organizador de cristas (MICOS), um dos principais complexos formadores de sítios de contato na membrana interna mitocondrial, que é conservado de leveduras para humanos. Recentemente, aprimoramos ainda mais este método para identificar um novo sítio de contato consistindo de Cqd1 e o complexo Por1-Om14.

Introdução

As mitocôndrias desempenham uma variedade de funções diferentes em eucariotos, sendo a mais conhecida a produção de ATP através da fosforilação oxidativa. Outras funções incluem a produção de clusters ferro-enxofre, síntese lipídica e, em eucariotos superiores, sinalização de Ca2+ e indução de apoptose 1,2,3,4. Essas funções estão inseparavelmente ligadas à sua complexa ultraestrutura.

A ultraestrutura mitocondrial foi primeiramente descrita por microscopia eletrônica5. Foi demon....

Protocolo

1. Amortecedores e soluções de reserva

  1. Fazer uma solução de ácido 3-morfolinopano-1-sulfónico (MOPS) 1 M em água deionizada, pH 7,4. Conservar a 4 °C.
  2. Preparar 500 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em água deionizada, pH 8,0. Conservar à temperatura ambiente.
  3. Preparar sorbitol 2,4 M em água deionizada. Armazenar à temperatura ambiente após autoclavagem.
  4. Preparar sacarose 2,5 M em água deionizada. Armazenar à temperatura ambiente após autoclavagem.
  5. Preparar fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) 200 mM em isopropanol. Conservar a -20 °C.
    CUIDADO: PMSF É TÓXICO se ingerido e causa queimadur....

Resultados Representativos

É relativamente fácil separar as membranas internas e externas mitocondriais. No entanto, a geração e separação de vesículas contendo o local de contato são muito mais difíceis. Em nossa opinião, duas etapas são críticas e essenciais: as condições de sonicação e o gradiente utilizado.

Normalmente, acredita-se que os gradientes lineares tenham uma resolução melhor em comparação com os gradientes de passos. No entanto, sua produção reprodutível é tediosa e requer equipame.......

Discussão

O subfracionamento mitocondrial é um experimento complicado com várias etapas altamente complexas. Assim, buscou-se aprimorar ainda mais e, até certo ponto, simplificar nosso método estabelecido32. Aqui, os desafios foram a exigência de equipamentos complicados e altamente especializados, que muitas vezes são construções individuais, e o enorme consumo de tempo e energia. Para tanto, procurou-se remover as bombas e construções individuais utilizadas para fundição e colheita do gradient.......

Divulgações

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Agradecimentos

M.E.H. reconhece a Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), projeto número 413985647, pelo apoio financeiro. Os autores agradecem ao Dr. Michael Kiebler, Ludwig-Maximilians University, Munique, por seu generoso e extenso apoio. Somos gratos a Walter Neupert por sua contribuição científica, discussões úteis e inspiração contínua. J.F. agradece à Graduate School Life Science Munich (LSM) pelo apoio.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mmBeckman Instruments, Germany344059
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mmBeckman Instruments, Germany363647
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x gBeckman Instruments, Germany363055
Abbe refractometerZeiss, Germanydiscontinued,
any pipet controller will suffice
accu-jet pro Pipet ControllerBrandtech, USABR26320discontinued,
any pipet controller will suffice
Beaker 1000 mLDWK Life Science, GermanyC118.1
Branson  Digital Sonifier W-250 DBranson Ultrasonics, USAFIS15-338-125
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIPBranson Ultrasonics, USA101-148-062
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling CellBranson Ultrasonics, USA15-338-70
Centrifuge Avanti JXN-26Beckman Instruments, GermanyB37912
Centrifuge Optima XPN-100 ultraBeckman Instruments, Germany8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-CocktailRoche, Switzerland11697498001
D-SorbitRoth, Germany6213
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate)Roth, Germany8043
Erlenmeyer flask, 100 mLRoth, GermanyX747.1
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1Hirschmann, Germany1180170
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05Hirschmann, Germany1180153
ice bathneoLab, Germany S12651
Magnetic stirrer RCT basicIKA-Werke GmbH, GermanyZ645060GB-1EA
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid)Gerbu, Germany1081
MyPipetman Select P1000Gilson, USAFP10006S
MyPipetman Select P20Gilson, USAFP10003S
MyPipetman Select P200Gilson, USAFP10005S
Omnifix 1 mLBraun, Germany4022495251879
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Serva, Germany32395.03
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mmBraun, Germany4022495052414
stirring bar, 15 mmVWR, USA442-0366
SucroseMerck, GermanyS8501
SW 41 Ti Swinging-Bucket RotorBeckman Instruments, Germany331362
Test tubesEppendorf, Germany3810X
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vesselVWR, USA432-0200
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tipVWR, USA432-0212
Trichloroacetic acid (TCA)Sigma Aldrich, Germany33731discontinued,
any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)
TRISRoth, Germany4855

Referências

  1. Braymer, J. J., Freibert, S. A., Rakwalska-bange, M., Lill, R. BBA - Molecular Cell Research Mechanistic concepts of iron-sulfur protein biogenesis in Biology * General concepts of FeS protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1868 (1), 118863 (2021).
  2. Osman, C., Merkwirth, C., Langer, T.

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