Mitokondriyal Temas Bölgelerini İzole Etmek için Geliştirilmiş Bir Yöntem

Özet

Mitokondriyal temas bölgeleri, mitokondriyal iç ve dış zar proteinleri ile etkileşime giren protein kompleksleridir. Bu bölgeler, mitokondriyal membranlar arasındaki ve dolayısıyla sitozol ile mitokondriyal matris arasındaki iletişim için gereklidir. Burada, bu spesifik protein sınıfına uygun adayları belirlemek için bir yöntem açıklıyoruz.

Özet

Mitokondri hemen hemen tüm ökaryotik hücrelerde bulunur ve enerji üretiminin çok ötesine geçen temel işlevleri yerine getirir, örneğin demir-kükürt kümelerinin, lipitlerin veya proteinlerin sentezi,^Ca2+ tamponlama ve apoptozun indüksiyonu. Benzer şekilde, mitokondriyal disfonksiyon kanser, diyabet ve nörodejenerasyon gibi ciddi insan hastalıklarına neden olur. Bu işlevleri yerine getirmek için mitokondri, iki zardan oluşan zarfları boyunca hücrenin geri kalanıyla iletişim kurmak zorundadır. Bu nedenle, bu iki zar sürekli etkileşim halinde olmak zorundadır. Mitokondriyal iç ve dış zarlar arasındaki proteinli temas bölgeleri bu açıdan gereklidir. Şimdiye kadar, birkaç temas yeri tespit edildi. Burada açıklanan yöntemde, Saccharomyces cerevisiae mitokondri, temas bölgelerini izole etmek ve böylece temas bölgesi proteinleri için uygun adayları belirlemek için kullanılır. Bu yöntemi, mayadan insanlara kadar korunan mitokondriyal iç zardaki ana temas bölgesi oluşturan komplekslerden biri olan mitokondriyal temas bölgesini ve cristae organizasyon sistemi (MICOS) kompleksini tanımlamak için kullandık. Son zamanlarda, Cqd1 ve Por1-Om14 kompleksinden oluşan yeni bir temas bölgesini tanımlamak için bu yöntemi daha da geliştirdik.

Giriş

Mitokondri, ökaryotlarda çeşitli farklı işlevleri yerine getirir, en bilineni oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretimidir. Diğer işlevler arasında demir-kükürt kümelerinin üretimi, lipid sentezi ve daha yüksek ökaryotlarda^Ca2+ sinyali ve apoptoz 1,2,3,4'ün indüksiyonu yer alır. Bu işlevler, karmaşık üst yapılarıyla ayrılmaz bir şekilde bağlantılıdır.

Mitokondriyal üst yapı ilk olarak elektron mikroskobu⁵ ile tanımlanmıştır. Mitokondrinin iki zardan oluşan oldukça karmaşık orga....

Protokol

1. Tamponlar ve stok çözeltileri

1. Deiyonize suda 1 M 3-morfolinopropan-1-sülfonik asit (MOPS) çözeltisi yapın, pH 7.4. 4 °C'de saklayın.
2. Deiyonize suda, pH 8.0 içinde 500 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
3. Deiyonize suda 2.4 M sorbitol hazırlayın. Otoklavlamadan sonra oda sıcaklığında saklayın.
4. Deiyonize suda 2,5 M sükroz hazırlayın. Otoklavlamadan sonra oda sıcaklığında saklayın.
5. İzopropanol içinde 200 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) hazırlayın. −20 °C'de saklayın.
   DİKKAT: PMSF yutulduğunda toksiktir ve ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olur.....

Tartışmalar

Mitokondriyal alt fraksiyonlama, oldukça karmaşık birkaç adımdan oluşan karmaşık bir deneydir. Bu nedenle, yerleşik yöntemimizi daha da geliştirmeyi ve bir dereceye kadar basitleştirmeyi amaçladık³². Buradaki zorluklar, genellikle bireysel yapılar olan karmaşık ve son derece özel ekipman gereksinimi ve muazzam zaman ve enerji tüketimiydi. Bu amaçla, doğrusal gradyanı dökmek ve hasat etmek için kullanılan pompaları ve münferit yapıları kaldırmaya çalıştık ve kademe.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm	Beckman Instruments, Germany	344059
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm	Beckman Instruments, Germany	363647
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g	Beckman Instruments, Germany	363055
Abbe refractometer	Zeiss, Germany		discontinued, any pipet controller will suffice
accu-jet pro Pipet Controller	Brandtech, USA	BR26320	discontinued, any pipet controller will suffice
Beaker 1000 mL	DWK Life Science, Germany	C118.1
Branson  Digital Sonifier W-250 D	Branson Ultrasonics, USA	FIS15-338-125
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP	Branson Ultrasonics, USA	101-148-062
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell	Branson Ultrasonics, USA	15-338-70
Centrifuge Avanti JXN-26	Beckman Instruments, Germany	B37912
Centrifuge Optima XPN-100 ultra	Beckman Instruments, Germany	8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail	Roche, Switzerland	11697498001
D-Sorbit	Roth, Germany	6213
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate)	Roth, Germany	8043
Erlenmeyer flask, 100 mL	Roth, Germany	X747.1
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1	Hirschmann, Germany	1180170
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05	Hirschmann, Germany	1180153
ice bath	neoLab, Germany	S12651
Magnetic stirrer RCT basic	IKA-Werke GmbH, Germany	Z645060GB-1EA
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid)	Gerbu, Germany	1081
MyPipetman Select P1000	Gilson, USA	FP10006S
MyPipetman Select P20	Gilson, USA	FP10003S
MyPipetman Select P200	Gilson, USA	FP10005S
Omnifix 1 mL	Braun, Germany	4022495251879
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Serva, Germany	32395.03
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm	Braun, Germany	4022495052414
stirring bar, 15 mm	VWR, USA	442-0366
Sucrose	Merck, Germany	S8501
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Instruments, Germany	331362
Test tubes	Eppendorf, Germany	3810X
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel	VWR, USA	432-0200
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip	VWR, USA	432-0212
Trichloroacetic acid (TCA)	Sigma Aldrich, Germany	33731	discontinued, any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)
TRIS	Roth, Germany	4855