Mitokondriyal Temas Bölgelerini İzole Etmek için Geliştirilmiş Bir Yöntem

Özet

Mitokondriyal temas bölgeleri, mitokondriyal iç ve dış zar proteinleri ile etkileşime giren protein kompleksleridir. Bu bölgeler, mitokondriyal membranlar arasındaki ve dolayısıyla sitozol ile mitokondriyal matris arasındaki iletişim için gereklidir. Burada, bu spesifik protein sınıfına uygun adayları belirlemek için bir yöntem açıklıyoruz.

Özet

Mitokondri hemen hemen tüm ökaryotik hücrelerde bulunur ve enerji üretiminin çok ötesine geçen temel işlevleri yerine getirir, örneğin demir-kükürt kümelerinin, lipitlerin veya proteinlerin sentezi,^Ca2+ tamponlama ve apoptozun indüksiyonu. Benzer şekilde, mitokondriyal disfonksiyon kanser, diyabet ve nörodejenerasyon gibi ciddi insan hastalıklarına neden olur. Bu işlevleri yerine getirmek için mitokondri, iki zardan oluşan zarfları boyunca hücrenin geri kalanıyla iletişim kurmak zorundadır. Bu nedenle, bu iki zar sürekli etkileşim halinde olmak zorundadır. Mitokondriyal iç ve dış zarlar arasındaki proteinli temas bölgeleri bu açıdan gereklidir. Şimdiye kadar, birkaç temas yeri tespit edildi. Burada açıklanan yöntemde, Saccharomyces cerevisiae mitokondri, temas bölgelerini izole etmek ve böylece temas bölgesi proteinleri için uygun adayları belirlemek için kullanılır. Bu yöntemi, mayadan insanlara kadar korunan mitokondriyal iç zardaki ana temas bölgesi oluşturan komplekslerden biri olan mitokondriyal temas bölgesini ve cristae organizasyon sistemi (MICOS) kompleksini tanımlamak için kullandık. Son zamanlarda, Cqd1 ve Por1-Om14 kompleksinden oluşan yeni bir temas bölgesini tanımlamak için bu yöntemi daha da geliştirdik.

Giriş

Mitokondri, ökaryotlarda çeşitli farklı işlevleri yerine getirir, en bilineni oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretimidir. Diğer işlevler arasında demir-kükürt kümelerinin üretimi, lipid sentezi ve daha yüksek ökaryotlarda^Ca2+ sinyali ve apoptoz 1,2,3,4'ün indüksiyonu yer alır. Bu işlevler, karmaşık üst yapılarıyla ayrılmaz bir şekilde bağlantılıdır.

Mitokondriyal üst yapı ilk olarak elektron mikroskobu⁵ ile tanımlanmıştır. Mitokondrinin iki zardan oluşan oldukça karmaşık organeller olduğu gösterilmiştir: mitokondriyal dış zar ve mitokondriyal iç zar. Böylece, bu membranlar tarafından iki sulu bölme oluşturulur: zarlar arası boşluk ve matris. Mitokondriyal iç zar daha da farklı bölümlere ayrılabilir. İç sınır zarı, dış zara yakın durur ve cristae istilalar oluşturur. Crista bağlantıları, iç sınır zarını ve cristae'yi birbirine bağlar (Şekil 1). Ayrıca, ozmotik olarak küçülmüş mitokondrinin elektron mikrografları, mitokondriyal zarların sıkıca bağlandığı bölgelerin var olduğunu ortaya koymaktadır ^6,7. Bu sözde temas bölgeleri, iki zarı kapsayan protein kompleksleri tarafından oluşturulur (Şekil 1). Bu etkileşim bölgelerinin, mitokondriyal dinamiklerin ve kalıtımın düzenlenmesinin yanı sıra sitozol ve matris⁸ arasındaki metabolitlerin ve sinyallerin transferi için önemleri nedeniyle hücre canlılığı için gerekli olduğu düşünülmektedir.

Mitokondriyal iç zardaki MICOS kompleksi, muhtemelen en iyi karakterize edilen ve en çok yönlü temas bölgesi oluşturan komplekstir. MICOS 2011 yılında mayada tanımlanmıştır ve altı alt birimden^{oluşur 9,10,1 1}: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19^, Mic12 ve ^Mic10. Bunlar, ^9,10,11 crista kavşaklarına lokalize olan yaklaşık ^1.5 MDa'lık bir kompleks oluşturur. Çekirdek alt birimin, Mic10 veya Mic60'ın silinmesi, bu karmaşık ^9,11'in yokluğuna yol açar, yani bu iki alt birim MICOS'un kararlılığı için gereklidir. İlginç bir şekilde, MICOS çeşitli mitokondriyal dış zar proteinleri ve kompleksleri ile sadece bir değil, birden fazla temas bölgesi oluşturur: TOM kompleksi 11,12, TOB / SAM kompleksi 9,12,13,14,15,16, Fzo1-Ugo1 kompleksi⁹, Por1 10^, OM45 10 ve Miro ¹⁷. Bu, MICOS kompleksinin protein ithalatı, fosfolipid metabolizması ve mitokondriyal ultrayapının¹⁸ oluşumu gibi çeşitli mitokondriyal süreçlerde yer aldığını güçlü bir şekilde gösterir. MIC10 veya MIC60'ın silinmesiyle indüklenen MICOS kompleksinin yokluğu, neredeyse tamamen düzenli kristadan yoksun anormal bir mitokondriyal üst yapıya yol açtığından, ikinci işlev muhtemelen MICOS'un ana işlevidir. Bunun yerine, iç sınır zarına bağlantısı olmayan iç zar vezikülleri^{19, 20} biriktirir. Daha da önemlisi, MICOS mayadan insana kadar form ve işlev bakımından korunur²¹. MICOS alt birimlerindeki mutasyonların ciddi insan hastalıkları ile ilişkisi, daha yüksek ökaryotlar için önemini de vurgulamaktadır^22,23. MICOS çok yönlü olmasına rağmen, ek temas siteleri mevcut olmalıdır (yayınlanmamış gözlemlerimize dayanarak). Gerçekten de, mitokondriyal spesifik fosfolipid kardiyolipin^27'nin biyosentezinde yer alan mitokondriyal füzyon makineleri Mgm1-Ugo1 / Fzo1^24,25,26 veya Mdm31-Por1 gibi birkaç başka temas bölgesi tanımlanmıştır. Son zamanlarda, dış membran kompleksi Por1-Om14²⁸ ile oluşturulan yeni bir temas bölgesinin parçası olarak Cqd1'i tanımlamak için bizi MICOS'un tanımlanmasına götüren yöntemi geliştirdik. İlginç bir şekilde, bu temas bölgesi aynı zamanda mitokondriyal membran homeostazı, fosfolipid metabolizması ve koenzim Q^28,29'un dağılımı gibi çoklu süreçlerde yer alıyor gibi görünmektedir.

Burada, daha önce tarif edilen mitokondri^{fraksiyonunun} bir varyasyonunu kullandık 9,30,31,32,33. Mitokondrinin ozmotik tedavisi, mitokondriyal dış zarın bozulmasına ve matris boşluğunun büzülmesine yol açar ve iki zarı sadece temas bölgelerinde yakın mesafede bırakır. Bu, yalnızca mitokondriyal dış zardan veya mitokondriyal iç zardan oluşan veziküllerin üretilmesine veya hafif sonikasyon yoluyla her iki zarın temas bölgelerini içermesine izin verir. Mitokondriyal iç zarın çok daha yüksek protein-lipit oranına sahip olması nedeniyle, mitokondriyal iç zar vezikülleri, mitokondriyal dış zar veziküllerine kıyasla daha yüksek bir yoğunluk sergiler. Yoğunluk farkı, sükroz yüzdürme yoğunluğu gradyan santrifüjlemesi yoluyla membran veziküllerini ayırmak için kullanılabilir. Böylece, mitokondriyal dış zar vezikülleri düşük sükroz konsantrasyonlarında birikirken, mitokondriyal iç zar vezikülleri yüksek sükroz konsantrasyonlarında zenginleşir. Temas bölgelerini içeren veziküller, ara sükroz konsantrasyonlarında yoğunlaşır (Şekil 2). Aşağıdaki protokol, daha önce kurduğumuz³² yönteme kıyasla daha az özel ekipman, zaman ve enerji gerektiren bu geliştirilmiş yöntemi ayrıntılı olarak açıklamakta ve olası temas bölgesi proteinlerinin tanımlanması için yararlı bir araç sağlamaktadır.

Protokol

1. Tamponlar ve stok çözeltileri

1. Deiyonize suda 1 M 3-morfolinopropan-1-sülfonik asit (MOPS) çözeltisi yapın, pH 7.4. 4 °C'de saklayın.
2. Deiyonize suda, pH 8.0 içinde 500 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) hazırlayın. Oda sıcaklığında saklayın.
3. Deiyonize suda 2.4 M sorbitol hazırlayın. Otoklavlamadan sonra oda sıcaklığında saklayın.
4. Deiyonize suda 2,5 M sükroz hazırlayın. Otoklavlamadan sonra oda sıcaklığında saklayın.
5. İzopropanol içinde 200 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF) hazırlayın. −20 °C'de saklayın.
   DİKKAT: PMSF yutulduğunda toksiktir ve ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olur. Tozu solumayın ve koruyucu eldiven ve gözlük takın.
6. Deiyonize suda %72 trikloroasetik asit (TCA) hazırlayın. 4 °C'de saklayın.
   DİKKAT: TCA solunum yolu tahrişine, ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olabilir. Tozu solumayın ve koruyucu eldiven ve gözlük takın.
7. SM tamponunu hazırlayın: 20 mM MOPS ve 0.6 M sorbitol, pH 7.4.
8. Şişme tamponunu hazırlayın: 20 mM MOPS, 0.5 mM EDTA, 1 mM PMSF ve proteaz inhibitör kokteyli, pH 7.4.
9. Sükroz gradyan tamponlarını hazırlayın: 20 mM MOPS'ta 0,8 M, 0,96 M, 1,02 M, 1,13 M ve 1,3 M sükroz ve 0,5 mM EDTA, pH 7,4.
   NOT: Tüm tamponlar 4 °C'de saklanabilir; bununla birlikte, mantar üremesini önlemek için sükroz içeren tamponların -20 °C'de saklanması önerilir. Proteaz inhibitörleri kullanımdan önce taze olarak eklenmelidir.

2. Submitochondrial veziküllerin oluşumu

1. Ham maya mitokondrisini yerleşik protokollere göre taze olarak izole edin^34,35.
   NOT: Bu deney için Saccharomyces cerevisiae'den mitokondri izole edilmiştir. Diğer organellerden yoksun gradyan saf mitokondri üretimi gerekli değildir.
2. 10 mg taze izole edilmiş mitokondriyi 1.6 mL SM tamponunda (4 °C) pipetleme ile yeniden süspanse edin (Şekil 2, adım 1).
3. Mitokondriyal süspansiyonu önceden soğutulmuş 100 mL Erlenmeyer şişesine aktarın.
4. 20 mL'lik bir cam pipet kullanarak yavaşça 16 mL şişme tamponu ekleyin. Ekleme sırasında buz üzerinde sürekli hafif karıştırarak uygulayın. Bu ozmotik arıtma, matris boşluğuna su alımına neden olur. Mitokondriyal iç zarın şişmesi dış zarı bozacaktır. Bununla birlikte, her iki membran da temas bölgelerinde temas halinde kalacaktır⁹ (Şekil 2, adım 2).
5. Numuneleri buz üzerinde 30 dakika boyunca sürekli hafif karıştırarak inkübe edin.
6. Numunelerdeki sükroz konsantrasyonunu yaklaşık 0,55 M'ye çıkarmak için 5 mL'lik bir cam pipet kullanarak yavaşça 5 mL 2,5 M sükroz çözeltisi ekleyin. Bu ozmotik işlem, matris^36'dan bir su akışı ile sonuçlanır. İç zarın büzülmesi, dış zarın artık parçalarına olan mesafesini en üst düzeye çıkarmak için tasarlanmıştır. Bu, sonikasyon yoluyla iç ve dış zarların yapay hibrit vezikülleri üretme olasılığını azaltır (Şekil 2, adım 3).
7. Numuneleri buz üzerinde 15 dakika hafif karıştırarak inkübe edin.
8. Submitochondrial membran vezikülleri oluşturmak için mitokondriyi sonikasyona tabi tutun (Şekil 2, adım 4).
   1. Mitokondriyal süspansiyonu önceden soğutulmuş bir rozet hücresine aktarın.
   2. Rozet hücresini bir buz banyosunda soğuturken mitokondriyal süspansiyonu 30 saniye boyunca% 10 genlikte sonikleştirin.
   3. Süspansiyonu bir buz banyosunda 30 saniye dinlendirin.
   4. Adım 2.8.2 ve adım 2.8.3'ü üç kez daha tekrarlayın.
      NOT: Sonikasyon koşulları, kullanılan sonikatöre göre değişecektir. Bireysel makineler için optimizasyon gerekli olacaktır. Çok sert olan sonikasyon, mitokondriyal iç ve dış zarlardan oluşan veziküllerin yapay oluşumuna yol açacaktır.

3. Submitokondriyal veziküllerin ayrılması

1. Üretilen vezikülleri, 4 ° C'de 20 dakika boyunca 20.000 x g'da santrifüjleme ile kalan bozulmamış mitokondriden ayırın. Sağlam mitokondri peletlenirken, veziküller süpernatantta kalacaktır.
2. Vezikül karışımını konsantre edin.
   1. Süpernatanı taze ultrasantrifüj tüplerine aktarın.
   2. 0,8 mm x 120 mm kanül ile donatılmış 1 mL'lik bir şırınga kullanarak tüpün dibine 0,3 mL 2,5 M sükroz çözeltisinden oluşan bir yastık yükleyin.
   3. 4 °C'de 100 dakika boyunca 118.000 x g'da santrifüjleyin.
      NOT: Burada, maksimum yarıçapı 153,1 mm olan sallanan bir kova rotoru kullanılmıştır. Santrifüjleme koşulları büyük ölçüde rotora bağlıdır ve başka bir rotor kullanıldığında uyarlanması gerekecektir.
3. Veziküller, santrifüjlemeden sonra sükroz yastığının üstünde bir disk olarak görünecektir. Süpernatantın yaklaşık% 90'ını atın. Şimdi, konsantre vezikülleri, yukarı ve aşağı pipetleyerek 2,5 M sükroz da dahil olmak üzere kalan tamponda yeniden süspanse ederek hasat edin. Süspansiyonu buz gibi bir Dounce homojenizatöre aktarın.
4. Bir politetrafloroetilen çömlekçi kullanarak süspansiyonu en az 10 vuruşla homojenize edin.
5. Sükroz gradyanını hazırlayın.
   1. Beş adımlı 11 mL'lik bir adım gradyanı için (20 mM MOPS ve 0.5 mM EDTA, pH 7.4'te 1.3 M, 1.13 M, 1.02 M, 0.96 M ve 0.8 M sükroz), her katmanda 2.2 mL sükroz çözeltisi bulunur.
      NOT: Sükroz konsantrasyonlarını ölçmek ve ayarlamak için bir refraktometre önerilir; Ancak, zorunlu değildir. Refraktometreye 10 μL tampon uygulayın ve ilgili kırılma indekslerini tespit edin. Sükroz konsantrasyonunun hesaplanması aşağıdaki gibidir:
      
      1.3333, suyun kırılma indisini temsil eder. 0.048403, sulu çözeltilerde molar kırılmanın sakaroz konsantrasyonuna doğrusal ölçeklenmesinden elde edilen sükroza özgü bir dönüşüm indeksidir ³⁷.
   2. Santrifüj tüpüne en yüksek sakaroz konsantrasyonunu ekleyin ve tüpü −20 °C'ye koyun. Bir sonrakini uygulamadan önce katmanın tamamen donmasını bekleyin. Son katman eklenene kadar buna göre devam edin ve gradyanları −20 °C'de saklayın.
      NOT: Gradyanların çözülmesine izin vermek için deneyi başlatırken donmuş gradyanları 4 °C'ye aktarmayı unutmayın. Bu yaklaşık 3 saat sürecektir. Buradaki santrifüjleme için 13.2 mL kapasiteli sallanan bir kova rotoru kullanıldı. Farklı bir rotor kullanıldığında, gradyan adım hacimleri buna göre uyarlanmalıdır.
6. Bir refraktometre kullanarak numunelerin sakaroz konsantrasyonunu ölçün. Bir refraktometreye erişim yoksa, alternatif olarak sükroz konsantrasyonunun 2 M olduğu varsayılabilir. Bu sözde sükroz konsantrasyonu daha sonra bir sonraki adımın temeli olacaktır.
7. Uygun miktarda 20 mM MOPS, 0,5 mM EDTA, 1 mM PMSF ve proteaz inhibitör kokteyli, pH 7,4 ekleyerek sükroz konsantrasyonunu 0,6 M'ye ayarlayın. Sükroz konsantrasyonu ölçülmek yerine 2 M olarak tahmin ediliyorsa, ayarlamadan sonra konsantrasyonun yeterince düşük olup olmadığının test edilmesi önerilir. Bir test tüpünde 200 μL 0.8 M sükrozun üzerine numunenin küçük bir alikotunu (yaklaşık 50 μL) uygulayın. Numune 0.8 M sükrozun üzerinde kalmalıdır.
8. Numuneleri (yaklaşık 1 mL) sükroz gradyanının üzerine yükleyin (daha sonra başvurmak üzere %10'u saklayın). Gradyanın bozulmasını önlemek için dikkatli pipetleme önemlidir (Şekil 2, adım 5).
9. Vezikülleri 200.000 x g ve 4 °C'de 12 saat santrifüjleyerek ayırın. Mümkünse, gradyanın bozulmasını önlemek için santrifüjü hızlanma ve yavaşlamayı yavaşlatacak şekilde ayarlayın (Şekil 2, adım 6).
   NOT: Burada, maksimum yarıçapı 153,1 mm olan sallanan bir kova rotoru kullanılmıştır. Santrifüjleme koşulları büyük ölçüde rotora bağlıdır ve başka bir rotor kullanıldığında uyarlanması gerekecektir.
10. 1 mL'lik bir pipet kullanarak gradyanı yukarıdan aşağıya 700 μL'lik fraksiyonlar halinde hasat edin. Bu, yeterli bir çözünürlüğe izin veren 17 kesirle sonuçlanacaktır.

4. Submitochondrial veziküllerin analizi

1. SDS-PAGE numunelerini hazırlamak için her bir fraksiyonu ardışık olarak gerçekleştirilen iki TCA çökeltisine³⁸ tabi tutarak proteinleri konsantre edin.
   1. Tek tek fraksiyonlara 200 μL% 72 TCA ekleyin ve çözelti homojen olana kadar karıştırın. Fraksiyonları buz üzerinde 30 dakika inkübe edin ve çökeltilmiş proteinleri 20.000 x g ve 4 ° C'de 20 dakika santrifüjleyerek peletleyin. Süpernatanı atın, 500 μL %28 TCA çözeltisi ekleyin, iyice karıştırın ve santrifüjleme adımını tekrarlayın.
   2. Peletleri 1 mL asetonla (-20°C) yıkayın ve 20.000 x g ve 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peletlerin kurumasını bekleyin. Peletleri 60 μL SDS numune tamponunda yeniden süspanse edin ve numuneleri 95 °C'de 5 dakika inkübe edin.
      NOT: İlk TCA çökelmesinden sonra, özellikle yüksek yoğunluklu fraksiyonlarda büyük miktarda sükroz kalacaktır. Bu, ek TCA yağışı yoluyla ortadan kaldırılacaktır.
2. SDS-PAGE³⁹ ve immünoblotlama 40,41,42,43 ile her fraksiyonun ²⁰ μL'sini analiz edin.

Sonuçlar

Mitokondriyal iç ve dış zarları ayırmak nispeten kolaydır. Bununla birlikte, temas yeri içeren veziküllerin oluşturulması ve ayrılması çok daha zordur. Bize göre, iki adım kritik ve esastır: sonikasyon koşulları ve kullanılan gradyan.

Genellikle, doğrusal gradyanların adım gradyanlarına kıyasla daha iyi bir çözünürlüğe sahip olduğu düşünülür. Bununla birlikte, tekrarlanabilir üretimleri sıkıcıdır ve özel ekipman gerektirir. Bu nedenle, tek tek adımlar...

Tartışmalar

Mitokondriyal alt fraksiyonlama, oldukça karmaşık birkaç adımdan oluşan karmaşık bir deneydir. Bu nedenle, yerleşik yöntemimizi daha da geliştirmeyi ve bir dereceye kadar basitleştirmeyi amaçladık³². Buradaki zorluklar, genellikle bireysel yapılar olan karmaşık ve son derece özel ekipman gereksinimi ve muazzam zaman ve enerji tüketimiydi. Bu amaçla, doğrusal gradyanı dökmek ve hasat etmek için kullanılan pompaları ve münferit yapıları kaldırmaya çalıştık ve kademe...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm	Beckman Instruments, Germany	344059
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm	Beckman Instruments, Germany	363647
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g	Beckman Instruments, Germany	363055
Abbe refractometer	Zeiss, Germany		discontinued, any Abbe refractometer can be used
accu-jet pro Pipet Controller	Brandtech, USA	BR26320	discontinued, any pipet controller will suffice
Beaker 1000 mL	DWK Life Science, Germany	C118.1
Branson  Digital Sonifier W-250 D	Branson Ultrasonics, USA	FIS15-338-125
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP	Branson Ultrasonics, USA	101-148-062
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell	Branson Ultrasonics, USA	15-338-70
Centrifuge Avanti JXN-26	Beckman Instruments, Germany	B37912
Centrifuge Optima XPN-100 ultra	Beckman Instruments, Germany	8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail	Roche, Switzerland	11697498001
D-Sorbit	Roth, Germany	6213
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate)	Roth, Germany	8043
Erlenmeyer flask, 100 mL	Roth, Germany	X747.1
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1	Hirschmann, Germany	1180170
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05	Hirschmann, Germany	1180153
ice bath	neoLab, Germany	S12651
Magnetic stirrer RCT basic	IKA-Werke GmbH, Germany	Z645060GB-1EA
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid)	Gerbu, Germany	1081
MyPipetman Select P1000	Gilson, USA	FP10006S
MyPipetman Select P20	Gilson, USA	FP10003S
MyPipetman Select P200	Gilson, USA	FP10005S
Omnifix 1 mL	Braun, Germany	4022495251879
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Serva, Germany	32395.03
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm	Braun, Germany	4022495052414
stirring bar, 15 mm	VWR, USA	442-0366
Sucrose	Merck, Germany	S8501
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Instruments, Germany	331362
Test tubes	Eppendorf, Germany	3810X
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel	VWR, USA	432-0200
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip	VWR, USA	432-0212
Trichloroacetic acid (TCA)	Sigma Aldrich, Germany	33731	discontinued, any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)
TRIS	Roth, Germany	4855