一种分离线粒体接触位点的改进方法

摘要

线粒体接触位点是与线粒体内膜和外膜蛋白相互作用的蛋白质复合物。这些位点对于线粒体膜之间的通信以及胞质溶胶和线粒体基质之间的通信至关重要。在这里，我们描述了一种识别符合这一特定类别蛋白质条件的候选者的方法。

摘要

线粒体几乎存在于所有真核细胞中，其基本功能远远超出了能量产生，例如，铁硫簇、脂质或蛋白质的合成、Ca²⁺ 缓冲和诱导细胞凋亡。同样，线粒体功能障碍会导致严重的人类疾病，如癌症、糖尿病和神经退行性疾病。为了执行这些功能，线粒体必须通过其包膜与细胞的其余部分进行通信，该包膜由两个膜组成。因此，这两种膜必须不断相互作用。在这方面，线粒体内膜和外膜之间的蛋白质接触位点是必不可少的。到目前为止，已经确定了几个接触点。在此描述的方法中， 酿酒酵 母线粒体用于分离接触位点，从而确定符合接触位点蛋白条件的候选物。我们使用这种方法鉴定了线粒体接触位点和嵴组织系统（MICOS）复合物，这是线粒体内膜中主要的接触位点形成复合物之一，从酵母到人类都是保守的。最近，我们进一步改进了这种方法，以鉴定由 Cqd1 和 Por1-Om14 复合物组成的新接触位点。

引言

线粒体在真核生物中发挥着各种不同的功能，其中最著名的是通过氧化磷酸化产生ATP。其他功能包括铁硫簇的产生、脂质合成，以及在高等真核生物中，^Ca2+ 信号传导和诱导细胞凋亡 1,2,3,4。这些功能与其复杂的超微结构密不可分。

线粒体超微结构首先通过电子显微镜⁵ 描述。结果表明，线粒体是由两层膜组成的相当复杂的细胞器：线粒体外膜和线粒体内膜。因此，这些膜形成了两个水室：膜间空间和基质。线粒体内膜可以进一步分为不同的部分。内边界膜与外膜保持紧密联系，嵴形成内陷。所谓的嵴连接连接内边界膜和嵴（图1）。此外，渗透收缩的线粒体的电子显微照片显示存在线粒体膜紧密连接的位点 ^6,7。这些所谓的接触位点是由跨越两个膜的蛋白质复合物形成的（图1）。人们认为，这些相互作用位点对于细胞活力至关重要，因为它们对线粒体动力学和遗传的调节以及胞质溶....

研究方案

1. 缓冲液和储备溶液

1. 在去离子水中制备 1 M 3-吗啉基丙烷-1-磺酸 （MOPS） 溶液，pH 7.4。储存在4°C。
2. 在去离子水中制备500mM乙二胺四乙酸（EDTA），pH 8.0。在室温下储存。
3. 在去离子水中制备2.4M山梨糖醇。高压灭菌后在室温下储存。
4. 在去离子水中制备2.5M蔗糖。高压灭菌后在室温下储存。
5. 在异丙醇中制备200mM苯甲基磺酰氟（PMSF）。储存在-20°C。
   注意：PMSF 如果吞咽是有毒的，会导致严重的皮肤灼伤和眼睛损伤。不要吸入灰尘，并戴上防护手套和护目镜。
6. 在去离子水中制备72%的三氯乙酸（TCA）。储存在4°C。
   注意：TCA 可能会导致呼吸道刺激、严重皮肤灼伤和眼睛损伤。不要吸入灰尘，并戴上防护手套和护目镜。
7. 准备SM缓冲液：20mM MOPS和0.6M山梨糖醇，pH 7.4。
8. 准备溶胀缓冲液：20 mM MOPS、0.5 mM EDTA、1 mM PMSF 和蛋白酶抑制剂混合物，pH 7.4。
9. 制备蔗糖梯度缓冲液：0.8 M、0.96 M、1.02 M、1.13 M 和 1.3 M 蔗糖，溶于 20 mM MOPS 和 0.5 mM EDTA，pH 7.4。
   注意：所有缓冲液都可以储存在4°C;然而，建议将含蔗糖的缓冲液储存在-20°C以避免真菌生长。蛋白酶抑....

讨论

线粒体亚分割是一项复杂的实验，具有几个高度复杂的步骤。因此，我们的目标是进一步改进并在一定程度上简化我们既定的方法³²。在这里，挑战是对复杂和高度专业化设备的要求，这些设备通常是单独的结构，以及巨大的时间和能源消耗。为此，我们尝试移除用于铸造和收获线性梯度的泵和单个结构，并将其更改为阶梯梯度。重要的是，我们意识到，至少在按此处所述制备?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm	Beckman Instruments, Germany	344059
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm	Beckman Instruments, Germany	363647
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g	Beckman Instruments, Germany	363055
Abbe refractometer	Zeiss, Germany		discontinued, any pipet controller will suffice
accu-jet pro Pipet Controller	Brandtech, USA	BR26320	discontinued, any pipet controller will suffice
Beaker 1000 mL	DWK Life Science, Germany	C118.1
Branson  Digital Sonifier W-250 D	Branson Ultrasonics, USA	FIS15-338-125
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP	Branson Ultrasonics, USA	101-148-062
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell	Branson Ultrasonics, USA	15-338-70
Centrifuge Avanti JXN-26	Beckman Instruments, Germany	B37912
Centrifuge Optima XPN-100 ultra	Beckman Instruments, Germany	8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail	Roche, Switzerland	11697498001
D-Sorbit	Roth, Germany	6213
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate)	Roth, Germany	8043
Erlenmeyer flask, 100 mL	Roth, Germany	X747.1
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1	Hirschmann, Germany	1180170
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05	Hirschmann, Germany	1180153
ice bath	neoLab, Germany	S12651
Magnetic stirrer RCT basic	IKA-Werke GmbH, Germany	Z645060GB-1EA
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid)	Gerbu, Germany	1081
MyPipetman Select P1000	Gilson, USA	FP10006S
MyPipetman Select P20	Gilson, USA	FP10003S
MyPipetman Select P200	Gilson, USA	FP10005S
Omnifix 1 mL	Braun, Germany	4022495251879
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Serva, Germany	32395.03
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm	Braun, Germany	4022495052414
stirring bar, 15 mm	VWR, USA	442-0366
Sucrose	Merck, Germany	S8501
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Instruments, Germany	331362
Test tubes	Eppendorf, Germany	3810X
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel	VWR, USA	432-0200
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip	VWR, USA	432-0212
Trichloroacetic acid (TCA)	Sigma Aldrich, Germany	33731	discontinued, any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)
TRIS	Roth, Germany	4855