שיטה משופרת לבידוד אתרי מגע מיטוכונדריאליים

Summary

אתרי מגע מיטוכונדריאליים הם קומפלקסים חלבוניים המקיימים אינטראקציה עם חלבוני הממברנה הפנימית והחיצונית של המיטוכונדריה. אתרים אלה חיוניים לתקשורת בין קרומי המיטוכונדריה, ולכן בין הציטוזול לבין המטריצה המיטוכונדריאלית. במאמר זה אנו מתארים שיטה לזיהוי מועמדים המתאימים לסוג מסוים זה של חלבונים.

Abstract

מיטוכונדריה נמצאים כמעט בכל התאים האיקריוטים ומבצעים תפקידים חיוניים הרבה מעבר לייצור אנרגיה, למשל, סינתזה של צבירי ברזל-גופרית, שומנים או חלבונים, חציצה Ca²⁺ והשראת אפופטוזיס. כמו כן, תפקוד לקוי של המיטוכונדריה גורם למחלות אנושיות חמורות כמו סרטן, סוכרת וניוון עצבי. כדי לבצע את הפונקציות האלה, המיטוכונדריה צריכים לתקשר עם שאר התא דרך המעטפת שלהם, המורכבת משני קרומים. לכן, שני קרומים אלה צריכים לקיים אינטראקציה כל הזמן. אתרי מגע חלבוניים בין הקרומים הפנימיים והחיצוניים של המיטוכונדריה חיוניים מבחינה זו. עד כה אותרו מספר אתרי קשר. בשיטה המתוארת כאן, משתמשים במיטוכונדריה של Saccharomyces cerevisiae כדי לבודד אתרי מגע, ובכך לזהות מועמדים המתאימים לחלבוני אתר מגע. השתמשנו בשיטה זו כדי לזהות את אתר המגע המיטוכונדריאלי ואת קומפלקס מערכת ארגון הקריסטות (MICOS), אחד הקומפלקסים העיקריים ליצירת אתרי מגע בקרום הפנימי של המיטוכונדריה, אשר נשמר משמרים לבני אדם. לאחרונה, שיפרנו עוד יותר שיטה זו כדי לזהות אתר קשר חדשני המורכב מ- Cqd1 וממתחם Por1-Om14.

Introduction

מיטוכונדריה מבצעים מגוון תפקידים שונים באיקריוטים, כאשר הידוע ביותר הוא ייצור ATP באמצעות זרחן חמצוני. פונקציות אחרות כוללות ייצור של אשכולות ברזל-גופרית, סינתזת שומנים, ובאיקריוטים גבוהים יותר, איתות Ca²⁺, והשראת אפופטוזיס 1,2,3,4. פונקציות אלה קשורות באופן בלתי נפרד Ultrastructure מורכב שלהם.

מבנה העל המיטוכונדריאלי תואר לראשונה במיקרוסקופ אלקטרונים⁵. הוכח כי מיטוכונדריה הם אברונים מורכבים למדי המורכבים משני קרומים: הקרום החיצוני של המיטוכונדריה והקרום הפנימי של המיטוכונדריה. לפיכך, שני תאים מימיים נוצרים על ידי ממברנות אלה: החלל intermembrane ואת המטריצה. ניתן לחלק עוד יותר את הקרום הפנימי של המיטוכונדריה לחלקים שונים. קרום הגבול הפנימי נשאר בסמיכות לקרום החיצוני, והקריסטה יוצרת פלישות. מה שנקרא צמתי קריסטה מחברים בין קרום הגבול הפנימי לבין הקריסטה (איור 1). יתר על כן, מיקרוגרפים אלקטרוניים של מיטוכונדריה מכווצים אוסמוטית מגלים כי קיימים אתרים שבהם קרומי המיטוכונדריה מחוברים באופן הדוק ^6,7. אתרי המגע האלה כביכול נוצרים על-ידי קומפלקסים חלבוניים המשתרעים על פני שני הממברנות (איור 1). נהוג לחשוב כי אתרי אינטראקציה אלה חיוניים לקיום התא בשל חשיבותם לוויסות הדינמיקה והתורשה של המיטוכונדריה, כמו גם להעברת מטבוליטים ואותות בין הציטוזול למטריצה⁸.

קומפלקס MICOS בקרום הפנימי של המיטוכונדריה הוא כנראה המאופיין ביותר והמורכב הרב-תכליתי ביותר ליצירת אתרי מגע. MICOS תואר בשמרים בשנת 2011, והוא מורכב משש תת-יחידות 9,10,1 1: Mic60, Mic27, Mic26, Mic19^, Mic12 ו-Mic10. אלה יוצרים קומפלקס של כ 1.5 MDa אשר מתמקם לצמתים^crista 9,10,11. המחיקה של אחת מתת-יחידות הליבה, Mic10 או Mic60, מובילה להיעדרו של קומפלקס ^9,11, כלומר שתי תת-יחידות אלה חיוניות ליציבות של MICOS. באופן מעניין, MICOS יוצר לא רק אתר מגע אחד אלא גם אתרי מגע מרובים עם חלבונים וקומפלקסים שונים של הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה: קומפלקס TOM 11,12^, קומפלקס TOB/SAM 9,12,13,14,15,16, קומפלקס Fzo1-Ugo1⁹,^Por1 10^, OM45^{10 ומירו 17}. זה מצביע מאוד על כך שקומפלקס MICOS מעורב בתהליכים מיטוכונדריאליים שונים, כגון ייבוא חלבונים, מטבוליזם של פוספוליפידים ויצירת אולטרה-מבנה מיטוכונדריאלי¹⁸. הפונקציה האחרונה היא ככל הנראה הפונקציה העיקרית של MICOS, שכן היעדר קומפלקס MICOS המושרה באמצעות מחיקה של MIC10 או MIC60 מוביל לאולטרה-מבנה מיטוכונדריאלי חריג שחסר כמעט לחלוטין קריסטה סדירה. במקום זאת, שלפוחיות קרום פנימיות ללא חיבור לקרום הגבול הפנימי מצטברות^{19, 20}. חשוב לציין, MICOS נשמר בצורה ובתפקוד משמרים לבני אדם²¹. הקשר של מוטציות בתת-יחידות MICOS עם מחלות אנושיות קשות מדגיש גם את חשיבותו לאיקריוטים גבוהים יותר^22,23. למרות ש-MICOS הוא רב-תכליתי ביותר, חייבים להתקיים אתרי קשר נוספים (בהתבסס על התצפיות שלנו שלא פורסמו). ואכן, זוהו מספר אתרי מגע אחרים, למשל, מכונות האיחוי המיטוכונדריאלי Mgm1-Ugo1/Fzo1 24,25,26 או Mdm31-Por1^, המעורבות בביוסינתזה של קרדיוליפין פוספוליפיד ²⁷ ספציפי למיטוכונדריה. לאחרונה, שיפרנו את השיטה שהובילה אותנו לזיהוי MICOS לזיהוי Cqd1 כחלק מאתר קשר חדשני שנוצר עם קומפלקס הממברנה החיצונית Por1-Om14²⁸. באופן מעניין, נראה כי אתר מגע זה מעורב גם בתהליכים מרובים כגון הומאוסטזיס של קרום המיטוכונדריה, מטבוליזם של פוספוליפידים והתפלגות קואנזים Q^28,29.

כאן, השתמשנו בווריאציה של השבר שתואר קודם לכן של מיטוכונדריה 9,30,31,32,33. טיפול אוסמוטי במיטוכונדריה מוביל לשיבוש הקרום החיצוני של המיטוכונדריה ולהתכווצות חלל המטריצה, מה שמשאיר את שני הקרומים רק בסמיכות באתרי מגע. זה מאפשר יצירת שלפוחיות המורכבות אך ורק מהקרום החיצוני של המיטוכונדריה או מהקרום הפנימי של המיטוכונדריה או באתרי מגע של שני הממברנות באמצעות סוניקציה קלה. בשל היחס בין חלבון לשומנים בקרום הפנימי של המיטוכונדריה, שלפוחיות הקרום הפנימי של המיטוכונדריה מציגות צפיפות גבוהה יותר בהשוואה לשלפוחיות הקרום החיצוני של המיטוכונדריה. ההבדל בצפיפות יכול לשמש להפרדת שלפוחיות הממברנה באמצעות צנטריפוגה הדרגתית צפיפות ציפה סוכרוז. לפיכך, שלפוחיות הקרום החיצוני של המיטוכונדריה מצטברות בריכוזי סוכרוז נמוכים, בעוד שלפוחיות הקרום הפנימי של המיטוכונדריה מועשרות בריכוזי סוכרוז גבוהים. השלפוחיות שמכילות אתרי מגע מתרכזות בריכוזי סוכרוז בינוניים (איור 2). הפרוטוקול הבא מתאר בפירוט שיטה משופרת זו, הדורשת פחות ציוד, זמן ואנרגיה מיוחדים בהשוואה לשיטה³² שהוקמה בעבר, ומספק כלי שימושי לזיהוי חלבונים אפשריים באתר המגע.

Protocol

1. מאגרים ופתרונות מלאי

1. הכינו תמיסת 1 M 3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS) במים שעברו דה-יוניזציה, pH 7.4. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
2. הכן 500 mM ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) במים deionized, pH 8.0. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
3. הכינו סורביטול 2.4 מ 'במים נטולי יונים. יש לאחסן בטמפרטורת החדר לאחר האוטוקלאבינג.
4. מכינים סוכרוז 2.5 מ 'במים deionized. יש לאחסן בטמפרטורת החדר לאחר האוטוקלאבינג.
5. הכינו 200 mM פנילמתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF) באיזופרופנול. יש לאחסן בטמפרטורה של -20°C.
   אזהרה: PMSF רעיל בבליעה וגורם לכוויות חמורות בעור ולנזק לעיניים. אין לנשום את האבק, וללבוש כפפות מגן ומשקפי מגן.
6. הכינו 72% חומצה טריכלורואצטית (TCA) במים שעברו דה-יוניזציה. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
   אזהרה: TCA עלול לגרום לגירוי נשימתי, כוויות עור חמורות ונזק לעיניים. אין לנשום את האבק, וללבוש כפפות מגן ומשקפי מגן.
7. הכן את מאגר SM: 20 mM MOPS ו 0.6 M סורביטול, pH 7.4.
8. הכינו את מאגר הנפיחות: 20 mM MOPS, 0.5 mM EDTA, 1 mM PMSF וקוקטייל מעכב פרוטאז, pH 7.4.
9. הכינו את מאגרי הסוכרוז ההדרגתיים: 0.8 M, 0.96 M, 1.02 M, 1.13 M ו-1.3 M סוכרוז ב-20 mM MOPS, ו-0.5 mM EDTA, pH 7.4.
   הערה: ניתן לאחסן את כל המאגרים ב- 4 °C; עם זאת, מומלץ לאחסן את המאגרים המכילים סוכרוז ב -20 מעלות צלזיוס כדי למנוע צמיחה פטרייתית. יש להוסיף את מעכבי הפרוטאז טריים לפני השימוש.

2. יצירת שלפוחיות הגשה

1. בודדו את המיטוכונדריה של שמרים גולמיים טריים על פי פרוטוקולים ^34,35 שנקבעו.
   הערה: עבור ניסוי זה, מיטוכונדריה בודדו מ Saccharomyces cerevisiae. אין צורך ביצירת מיטוכונדריה טהורה הדרגתית נטולת אברונים אחרים.
2. השהה מחדש 10 מ"ג של מיטוכונדריה מבודדת טרייה במאגר SM של 1.6 מ"ל (4°C) על-ידי פיפטינג (איור 2, שלב 1).
3. מעבירים את המתלה המיטוכונדריאלי לצלוחית Erlenmeyer מקוררת מראש בנפח 100 מ"ל.
4. להוסיף לאט 16 מ"ל של חיץ נפיחות באמצעות פיפטה זכוכית 20 מ"ל. יש למרוח ערבוב עדין קבוע על קרח במהלך התוספת. טיפול אוסמוטי זה גורם לספיגת מים לחלל המטריצה. הנפיחות של הקרום הפנימי של המיטוכונדריה תשבש את הקרום החיצוני. אולם שני הקרומים יישארו בקשר באתרי הקשר⁹ (איור 2, שלב 2).
5. יש לדגור על הדגימות תוך ערבוב עדין מתמיד במשך 30 דקות על קרח.
6. הוסיפו באיטיות 5 מ"ל של תמיסת סוכרוז 2.5 מ"ל באמצעות פיפטת זכוכית 5 מ"ל כדי להעלות את ריכוז הסוכרוז בדגימות לכ-0.55 מ'. טיפול אוסמוטי זה גורם לשטף מים מהמטריצה³⁶. התכווצות הקרום הפנימי נועדה למקסם את מרחקו לשברים השיוריים של הקרום החיצוני. זה מקטין את ההסתברות ליצור בועיות היברידיות מלאכותיות של קרומים פנימיים וחיצוניים באמצעות סוניקציה (איור 2, שלב 3).
7. יש לדגור על הדגימות תוך ערבוב עדין במשך 15 דקות על קרח.
8. העבירו את המיטוכונדריה לסוניקציה כדי ליצור בועיות קרום כניעה (איור 2, שלב 4).
   1. מעבירים את התרחיף המיטוכונדריאלי לתא רוזטה מקורר מראש.
   2. הפעילו את המתלה המיטוכונדריאלי באמפליטודה של 10% למשך 30 שניות תוך קירור תא הרוזטה באמבט קרח.
   3. הניחו את המתלה למשך 30 שניות באמבט קרח.
   4. חזור על שלב 2.8.2 ושלב 2.8.3 שלוש פעמים נוספות.
      הערה: תנאי הסוניקציה ישתנו בהתאם לסוניק שבו נעשה שימוש. אופטימיזציה יהיה צורך עבור מכונות בודדות. סוניקציה קשה מדי תוביל להיווצרות מלאכותית של שלפוחיות המורכבות מממברנות פנימיות וחיצוניות של המיטוכונדריה.

3. הפרדת שלפוחיות submitochondrial

1. יש להפריד את השלפוחיות שנוצרו מהמיטוכונדריה הנותרת על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 20,000 x גרם למשך 20 דקות ב-4°C. המיטוכונדריה השלמים ייפלטו ואילו השלפוחיות יישארו בסופרנטנט.
2. רכזים את תערובת השלפוחית.
   1. מעבירים את הסופרנאטנט לצינורות אולטרה-צנטריפוגה טריים.
   2. טען כרית של 0.3 מ"ל של תמיסת סוכרוז 2.5 מ 'בתחתית הצינור באמצעות מזרק 1 מ"ל מצויד צינורית 0.8 מ"מ x 120 מ"מ.
   3. צנטריפוגה ב 118,000 x גרם במשך 100 דקות ב 4 ° C.
      הערה: כאן, רוטור דלי מתנדנד עם רדיוס מרבי של 153.1 מ"מ שימש. תנאי הצנטריפוגה תלויים מאוד ברוטור ויהיה צורך להתאים אותם כאשר נעשה שימוש ברוטור אחר.
3. השלפוחיות יופיעו כדיסק בחלק העליון של כרית הסוכרוז לאחר הצנטריפוגה. השליכו כ-90% מהסופרנטנט. כעת, קצרו את הבועיות המרוכזות על ידי השעייתן מחדש במאגר שנותר כולל סוכרוז באורך 2.5 מ' על ידי פיפטציה מעלה ומטה. מעבירים את המתלה להומוגנייזר Dounce קר כקרח.
4. הומוגניזציה של ההשעיה עם לפחות 10 שבץ באמצעות קדר polytetrafluoroethylene .
5. מכינים את שיפוע הסוכרוז.
   1. עבור שיפוע מדרגות של 11 מ"ל עם חמישה שלבים (1.3 מ', 1.13 מ', 1.02 מ', 0.96 מ' וסוכרוז 0.8 מ' ב-20 מ"מ MOPS ו-0.5 מ"מ EDTA, pH 7.4), בכל שכבה יש 2.2 מ"ל של תמיסת סוכרוז.
      הערה: מומלץ להשתמש ברפרקטומטר כדי למדוד ולהתאים את ריכוזי הסוכרוז; עם זאת, זה לא חיוני. החל 10 μL של המאגר על הרפרקטומטר, וזהה את מדדי השבירה המתאימים. חישוב ריכוז הסוכרוז הוא כדלקמן:
      
      1.3333 מייצג את מדד השבירה של המים. 0.048403 הוא מדד המרה ספציפי לסוכרוז המתקבל מקנה מידה ליניארי של שבירה מולרית לריכוז סוכרוז בתמיסות מימיות ³⁷.
   2. הוסף את ריכוז הסוכרוז הגבוה ביותר לצינור הצנטריפוגה, ושים את הצינור ב -20 מעלות צלזיוס. המתינו עד שהשכבה תוקפא לחלוטין לפני החלת השכבה הבאה. המשיכו בהתאם עד להוספת השכבה האחרונה, ואחסנו את מעברי הצבע ב -20 מעלות צלזיוס.
      הערה: זכור להעביר את מעברי הצבע הקפואים ל- 4 ° C בעת תחילת הניסוי כדי לאפשר למעברי הצבע להפשיר. זה ייקח בערך 3 שעות. עבור הצנטריפוגה כאן, רוטור דלי מתנדנד עם קיבולת של 13.2 מ"ל שימש. כאשר משתמשים ברוטור אחר, יש להתאים את נפחי מדרגות השיפוע בהתאם.
6. למדוד את ריכוז הסוכרוז של הדגימות באמצעות רפרקטומטר. אם אין גישה לרפרקטומטר, אפשר לחילופין להניח שריכוז הסוכרוז הוא 2 מ'. ריכוז סוכרוז משוער זה יהיה הבסיס לשלב הבא.
7. כוונן את ריכוז הסוכרוז ל 0.6 M על ידי תוספת של כמות מתאימה של 20 mM MOPS, 0.5 mM EDTA, 1 mM PMSF וקוקטייל מעכב פרוטאז, pH 7.4. אם ריכוז הסוכרוז מוערך כ-2 מ' במקום להימדד, מומלץ לבדוק האם הריכוז נמוך מספיק לאחר ההתאמה. החל aliquot קטן של הדגימה (כ 50 μL) על גבי 200 μL של 0.8 M סוכרוז במבחנה. הדגימה חייבת להישאר על גבי סוכרוז 0.8 M.
8. טען את הדגימות (כ -1 מ"ל) על גבי שיפוע הסוכרוז (שמור 10% להתייחסות מאוחרת יותר). צנרת זהירה חשובה כדי למנוע הפרעה של שיפוע (איור 2, שלב 5).
9. להפריד את שלפוחיות על ידי צנטריפוגה ב 200,000 x גרם ו 4 ° C במשך 12 שעות. במידת האפשר, כוונו את הצנטריפוגה להאטה ולהאטה כדי למנוע הפרעה של השיפוע (איור 2, שלב 6).
   הערה: כאן, רוטור דלי מתנדנד עם רדיוס מרבי של 153.1 מ"מ שימש. תנאי הצנטריפוגה תלויים מאוד ברוטור ויהיה צורך להתאים אותם כאשר נעשה שימוש ברוטור אחר.
10. קצרו את השיפוע מלמעלה למטה בשברים של 700 מיקרוליטר באמצעות פיפטה של 1 מ"ל. התוצאה תהיה 17 שברים, מה שמאפשר רזולוציה מספקת.

4. ניתוח שלפוחיות submitochondrial

1. רכז את החלבונים על ידי חשיפת כל שבר לשני משקעי TCA³⁸ המבוצעים ברצף כדי להכין את דגימות SDS-PAGE.
   1. הוסף 200 μL של 72% TCA לשברים בודדים, וערבב עד התמיסה הומוגנית. לדגור על השברים במשך 30 דקות על קרח, ולזרוק את החלבונים המושקעים על ידי צנטריפוגה ב 20,000 x גרם ו 4 ° C במשך 20 דקות. השליכו את הסופרנטנט, הוסיפו 500 מיקרוליטר של תמיסת TCA 28%, ערבבו היטב וחזרו על שלב הצנטריפוגה.
   2. שטפו את הכדוריות עם 1 מ"ל אצטון (-20°C), וצנטריפוגה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 20,000 x גרם ו-4°C. השליכו את הסופרנטנט, ותנו לכדוריות להתייבש. השהה מחדש את הכדוריות ב 60 μL של מאגר דגימת SDS, ודגר על הדגימות במשך 5 דקות ב 95 ° C.
      הערה: כמות גדולה של סוכרוז תישאר, במיוחד בשברים בעלי צפיפות גבוהה, לאחר משקעי TCA הראשונים. זה יוסר באמצעות משקעים TCA נוספים.
2. נתח 20 μL של כל שבר על ידי SDS-PAGE³⁹ ו immunoblotting^40,41,42,43.

תוצאות

קל יחסית להפריד בין הקרומים הפנימיים והחיצוניים של המיטוכונדריה. עם זאת, הדור וההפרדה של שלפוחיות המכילות אתרי מגע הם הרבה יותר קשה. לדעתנו, שני שלבים הם קריטיים וחיוניים: תנאי הסוניקציה והשיפוע שבו נעשה שימוש.

בדרך כלל, מעברי צבע ליניאריים נחשבים כבעלי רזולוציה טובה יותר ב?...

Discussion

תת-שבירה מיטוכונדריאלית היא ניסוי מסובך עם מספר שלבים מורכבים ביותר. לכן, כיוונו לשפר עוד יותר, ובמידה מסוימת, לפשט את השיטה המבוססת שלנו³². כאן, האתגרים היו הדרישה לציוד מסובך ומיוחד מאוד, שהם לעתים קרובות מבנים בודדים, ואת צריכת הזמן והאנרגיה העצומה. לשם כך ניסינו להסיר את המש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm	Beckman Instruments, Germany	344059
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm	Beckman Instruments, Germany	363647
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g	Beckman Instruments, Germany	363055
Abbe refractometer	Zeiss, Germany		discontinued, any Abbe refractometer can be used
accu-jet pro Pipet Controller	Brandtech, USA	BR26320	discontinued, any pipet controller will suffice
Beaker 1000 mL	DWK Life Science, Germany	C118.1
Branson  Digital Sonifier W-250 D	Branson Ultrasonics, USA	FIS15-338-125
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP	Branson Ultrasonics, USA	101-148-062
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell	Branson Ultrasonics, USA	15-338-70
Centrifuge Avanti JXN-26	Beckman Instruments, Germany	B37912
Centrifuge Optima XPN-100 ultra	Beckman Instruments, Germany	8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail	Roche, Switzerland	11697498001
D-Sorbit	Roth, Germany	6213
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate)	Roth, Germany	8043
Erlenmeyer flask, 100 mL	Roth, Germany	X747.1
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1	Hirschmann, Germany	1180170
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05	Hirschmann, Germany	1180153
ice bath	neoLab, Germany	S12651
Magnetic stirrer RCT basic	IKA-Werke GmbH, Germany	Z645060GB-1EA
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid)	Gerbu, Germany	1081
MyPipetman Select P1000	Gilson, USA	FP10006S
MyPipetman Select P20	Gilson, USA	FP10003S
MyPipetman Select P200	Gilson, USA	FP10005S
Omnifix 1 mL	Braun, Germany	4022495251879
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Serva, Germany	32395.03
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm	Braun, Germany	4022495052414
stirring bar, 15 mm	VWR, USA	442-0366
Sucrose	Merck, Germany	S8501
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Instruments, Germany	331362
Test tubes	Eppendorf, Germany	3810X
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel	VWR, USA	432-0200
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip	VWR, USA	432-0212
Trichloroacetic acid (TCA)	Sigma Aldrich, Germany	33731	discontinued, any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)
TRIS	Roth, Germany	4855