فحص وحدة تشكيل المستعمرات الدقيقة لتقييم فعالية اللقاحات ضد السل

Summary

تحديد وحدات تشكيل المستعمرات (CFU) هو الأسلوب القياسي الذهبي لقياس البكتيريا ، بما في ذلك المتفطرة السلية التي قد تستغرق أسابيع لتشكيل مستعمرات مرئية. هنا نصف وحدة CFU الصغيرة لتحديد CFU مع زيادة كفاءة الوقت ، وتقليل مساحة المختبر وتكلفة الكاشف ، وقابلية التوسع في تجارب الإنتاجية المتوسطة والعالية.

Abstract

قتل السل (TB) ، وهو السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم بسبب عامل معدي ، 1.6 مليون شخص في عام 2022 ، ولم يتجاوزه سوى COVID-19 خلال جائحة 2019-2021. هذا المرض ناجم عن بكتيريا المتفطرة السلية (M.tb). سلالة المتفطرة البوفية Bacillus Calmette-Guérin (BCG) ، لقاح السل الوحيد ، هي أقدم لقاح مرخص في العالم ، ولا يزال قيد الاستخدام. حاليا ، هناك 12 لقاحا في التجارب السريرية وعشرات اللقاحات قيد التطوير قبل السريري. الطريقة المفضلة المستخدمة لتقييم فعالية لقاحات السل في الدراسات قبل السريرية هي تعداد المستعمرات البكتيرية بواسطة فحص وحدات تكوين المستعمرات (CFU). يستغرق هذا الفحص الذي يستغرق وقتا طويلا من 4 إلى 6 أسابيع حتى ينتهي ، ويتطلب مساحة كبيرة للمختبر والحاضنة ، وله تكاليف كاشف عالية ، وعرضة للتلوث. نصف هنا طريقة محسنة لتعداد المستعمرات ، وهي micro-CFU (mCFU) ، والتي تقدم حلا بسيطا وسريعا لتحليل نتائج فعالية لقاح السل . يتطلب اختبار mCFU كواشف أقل بعشرة أضعاف ، ويقلل من فترة الحضانة ثلاثة أضعاف ، ويستغرق من 1 إلى 2 أسابيع للانتهاء ، ويقلل من مساحة المختبر وتكلفة الكاشف ، ويقلل من مخاطر الصحة والسلامة المرتبطة بالعمل مع أعداد كبيرة من M.tb. علاوة على ذلك ، لتقييم فعالية لقاح السل ، يمكن الحصول على عينات من مجموعة متنوعة من المصادر ، بما في ذلك الأنسجة من الملقحة المصابة بالمتفطرات. كما وصفنا طريقة محسنة لإنتاج ثقافة متفطرات أحادية الخلية وموحدة وعالية الجودة لدراسات العدوى. وأخيرا، نقترح اعتماد هذه الأساليب عالميا في الدراسات قبل السريرية لتحديد فعالية اللقاح، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى تقليل الوقت في تطوير لقاحات ضد السل.

Introduction

السل (TB) هو السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم من قبل عامل معدي واحد ، بكتيريا المتفطرة السلية (M.tb) ، مما يؤدي إلى مقتل عدد أكبر من الناس أكثر من أي ممرض آخر. في عام 2021 ، كان السل مسؤولا عن 1.6 مليون حالة وفاة وتجاوزه COVID-19 خلال جائحة 2019-2021¹. علاوة على ذلك ، وفقا لتقرير السل العالمي الصادر عن منظمة الصحة العالمية لعام 2022 ، كانت جائحة COVID-19 مسؤولة عن زيادة حالات السل الجديدة. كما أبلغت منظمة الصحة العالمية عن انخفاض كبير في عدد الأشخاص الذين تم تشخيص إصابتهم بالسل خلال هذه الفترة ، مما قد يزيد من عدد حالات السل¹.

Bacillus Calmette-Guérin (BCG) هي سلالة ....

Protocol

ملاحظة: البروتوكول الموضح هنا خاص ب BCG ولكن يمكن تطبيقه على أي متفطرات. يمكن استخدام BCG كبكتيريا بديلة لتجارب السل عندما لا تتوفر مرافق BSL3²². يجب تنفيذ الإجراءات التالية باستخدام BCG في مختبر مستوى السلامة البيولوجية 2 (BSL2) واتباع إرشادات السلامة البيولوجية المناسبة والممارسات المختبرية الجيدة لمعالجة الكائنات الحية الدقيقة من المجموعة الخطرة 2.

1. إعداد الإعلام الثقافي

1. قم بإعداد مرق Middlebrook 7H9 المكمل بتخصيب 10٪ (v / v) من حمض الأوليك والألبومين وسكر العنب والكاتلاز (OADC) ، وفقا لتعليمات المورد. تكملة المرق مع 0.05 ٪ (v / v) من tyloxapol.
   ملاحظة: Tyloxapol هو بوليمر سائل غير ....

النتائج

يزيد اختبار mCFU الموصوف هنا من كمية المعلومات التي يمكن استرجاعها من طبق بتري واحد إلى 96 ضعفا على الأقل. يصور الشكل 5 مقارنة بين طريقتين لتوصيل الدواء للاستخدام المعاد استخدامه لساكوينافير (SQV)^31,32 كدواء موجه للمضيف لعلاج السل. في هذا الفحص ، تم.......

Discussion

السل مشكلة صحية عمومية هامة تزداد أهميتها، ولا سيما في البلدان المنخفضة والمتوسطة الدخل. تسبب تعطل أماكن الرعاية الصحية لتشخيص السل وعلاجه أثناء جائحة كوفيد-19 في تأثير سلبي على حدوث الحالات الجديدة¹. وبالإضافة إلى ذلك، يجب التصدي على وجه الاستعجال لسلالات السل المتعددة .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plates	VWR	734-2781
DSLR 15-55 mm lens	Nikon	AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR
DSLR camera	Nikon	D3400
DSLR macro lens	Sigma	MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM
Fetal calf serum	Gibco	10270106
Fiji Software		https://fiji.sc/	Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included.
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	18896
L-glutamine	Gibco	25030-081
Middlebrook 7H10	BD	262710
Middlebrook 7H9	BD	271310
Multichannel pipette (0.5 - 10 µl)	Gilson	FA10013
Multichannel pipette (20 - 200 µl)	Gilson	FA10011
Mycobacterium bovis BCG	American Type Culture Collection	ATCC35734	strain TMC 1011 [BCG Pasteur]
OADC enrichment	BD	211886
Phosphate buffered saline (PBS)	NZYTech	MB25201
RPMI 1640 medium	Gibco	21875091
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Spectrophotometer UV-6300PC	VWR	634-6041
Square Petri dish 120 x 120 mm	Corning	BP124-05
Tyloxapol	Sigma-Aldrich	T8761
Ultrasound bath Elma P 30 H	VWR	142-0051