Tüberküloza Karşı Aşıların Etkinlik Değerlendirmesi için Mikro Koloni Oluşturan Birim Testi

Özet

Koloni oluşturan birimlerin (CFU) belirlenmesi, görünür koloniler oluşturması haftalar sürebilen Mycobacterium tuberculosis de dahil olmak üzere bakterilerin miktarını belirlemek için altın standart tekniktir. Burada, artan zaman verimliliği, azaltılmış laboratuvar alanı ve reaktif maliyeti ve orta ve yüksek verimli deneylere ölçeklenebilirlik ile CFU belirleme için bir mikro-CFU'yu açıklıyoruz.

Özet

Bulaşıcı bir ajan tarafından dünya çapında önde gelen ölüm nedeni olan tüberküloz (TB), 2022'de 1,6 milyon insanı öldürdü, ancak 2019-2021 pandemisi sırasında COVID-19 tarafından aşıldı. Hastalığa Mycobacterium tuberculosis (M.tb) bakterisi neden olur. Tek tüberküloz aşısı olan Mycobacterium bovis suşu Bacillus Calmette-Guérin (BCG), halen kullanımda olan dünyanın en eski lisanslı aşısıdır. Şu anda klinik deneylerde 12 aşı ve klinik öncesi geliştirilmekte olan düzinelerce aşı var. Klinik öncesi çalışmalarda TB aşılarının etkinliğini değerlendirmek için kullanılan tercih edilen yöntem, bakteri kolonilerinin koloni oluşturan birimler (CFU) testi ile sayımıdır. Bu zaman alıcı tahlilin sonuçlanması 4 ila 6 hafta sürer, önemli laboratuvar ve inkübatör alanı gerektirir, yüksek reaktif maliyetlerine sahiptir ve kontaminasyona eğilimlidir. Burada, M.tb aşısının etkinlik sonuçlarını analiz etmek için basit ve hızlı bir çözüm sunan, koloni sayımı için optimize edilmiş bir yöntem olan mikro-CFU'yu (mCFU) açıklıyoruz. mCFU tahlili on kat daha az reaktif gerektirir, kuluçka süresini üç kat azaltır, sonuçlanması 1 ila 2 hafta sürer, laboratuvar alanını ve reaktif maliyetini azaltır ve çok sayıda M.tb ile çalışmanın getirdiği sağlık ve güvenlik risklerini en aza indirir. Ayrıca, bir TB aşısının etkinliğini değerlendirmek için, Mikobakteriler ile enfekte olmuş aşılanmış hayvanlardan alınan dokular da dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan örnekler alınabilir. Ayrıca, enfeksiyon çalışmaları için tek hücreli, tek tip ve yüksek kaliteli bir mikobakteri kültürü üretmek için optimize edilmiş bir yöntem açıklıyoruz. Son olarak, bu yöntemlerin aşı etkinliğinin belirlenmesine yönelik klinik öncesi çalışmalar için evrensel olarak benimsenmesini ve sonuçta TB'ye karşı aşıların geliştirilmesinde zamanın azalmasına yol açmasını öneriyoruz.

Giriş

Tüberküloz (TB), tek bir enfeksiyöz ajan olan Mycobacterium tuberculosis (M.tb) bakterisinin dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir ve diğer tüm patojenlerden daha fazla insanı öldürür. 2021'de tüberküloz 1,6 milyon ölümden sorumluydu ve 2019-2021 pandemisi sırasında COVID-19 tarafından aşıldı¹. Ayrıca, Dünya Sağlık Örgütü'nün 2022 küresel TB raporuna göre, COVID-19 salgını yeni TB vakalarındaki artıştan sorumluydu. DSÖ ayrıca bu dönemde TB teşhisi konan kişi sayısında büyük düşüşler olduğunu ve bunun TB vakalarının sayısını daha da artırabileceğini bildirmektedir¹.

Bacillus....

Protokol

NOT: Burada açıklanan protokol BCG içindir ancak herhangi bir Mikobakteriye uygulanabilir. BCG, BSL3 tesislerinin bulunmadığı durumlarda TB deneyleri için vekil bir bakteri olarak kullanılabilir²². BCG kullanan aşağıdaki prosedürler, bir biyogüvenlik seviyesi 2 (BSL2) laboratuvarı altında gerçekleştirilmeli ve tehlike grubu 2 mikroorganizmalarının manipülasyonu için uygun biyogüvenlik yönergelerine ve iyi laboratuvar uygulamalarına uyulmalıdır.

1. Kültür ortamının hazırlanması

1. Tedarikçinin talimatlarına göre %7 (h/h) oleik asit, albümin, dekstroz ve katalaz (OADC) zenginleştirmesi ile deste....

Tartışmalar

Tüberküloz, özellikle düşük ve orta gelirli ülkelerde önemi giderek artan önemli bir halk sağlığı sorunudur. COVID-19 pandemisi sırasında tüberkülozu teşhis ve tedavi etmek için sağlık hizmeti ortamlarının bozulması, yeni vakaların görülme sıklığı üzerinde olumsuz bir etkiye neden olmuştur¹. Ek olarak, bu salgını kontrol etmek için çoklu ilaç ve yaygın ilaca dirençli M.tb suşları ve M.tb ve HIV'in birlikte enfeksiyonu acilen ele alınmal?.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plates	VWR	734-2781
DSLR 15-55 mm lens	Nikon	AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR
DSLR camera	Nikon	D3400
DSLR macro lens	Sigma	MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM
Fetal calf serum	Gibco	10270106
Fiji Software		https://fiji.sc/	Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included.
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	18896
L-glutamine	Gibco	25030-081
Middlebrook 7H10	BD	262710
Middlebrook 7H9	BD	271310
Multichannel pipette (0.5 - 10 µl)	Gilson	FA10013
Multichannel pipette (20 - 200 µl)	Gilson	FA10011
Mycobacterium bovis BCG	American Type Culture Collection	ATCC35734	strain TMC 1011 [BCG Pasteur]
OADC enrichment	BD	211886
Phosphate buffered saline (PBS)	NZYTech	MB25201
RPMI 1640 medium	Gibco	21875091
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Spectrophotometer UV-6300PC	VWR	634-6041
Square Petri dish 120 x 120 mm	Corning	BP124-05
Tyloxapol	Sigma-Aldrich	T8761
Ultrasound bath Elma P 30 H	VWR	142-0051