Mikrokoloniebildender Unit-Assay zur Wirksamkeitsbewertung von Impfstoffen gegen Tuberkulose

Zusammenfassung

Die Bestimmung koloniebildender Einheiten (KBE) ist die Goldstandard-Technik zur Quantifizierung von Bakterien, einschließlich Mycobacterium tuberculosis , die Wochen brauchen kann, um sichtbare Kolonien zu bilden. Hier beschreiben wir eine Mikrokbe für die KBE-Bestimmung mit erhöhter Zeiteffizienz, reduziertem Laborplatz und Reagenzienkosten sowie Skalierbarkeit auf Experimente mit mittlerem und hohem Durchsatz.

Zusammenfassung

Tuberkulose (TB), die weltweit häufigste Todesursache durch einen Infektionserreger, tötete im Jahr 2022 1,6 Millionen Menschen und wurde erst während der Pandemie 2019-2021 von COVID-19 übertroffen. Die Krankheit wird durch das Bakterium Mycobacterium tuberculosis (M.tb) verursacht. Der Mycobacterium bovis-Stamm Bacillus Calmette-Guérin (BCG), der einzige TB-Impfstoff, ist der älteste zugelassene Impfstoff der Welt, der noch verwendet wird. Derzeit befinden sich 12 Impfstoffe in klinischen Studien und Dutzende von Impfstoffen in der präklinischen Entwicklung. Die Methode der Wahl, um die Wirksamkeit von TB-Impfstoffen in präklinischen Studien zu beurteilen, ist die Zählung von Bakterienkolonien durch den Colony-Forming Units (KBE)-Assay. Dieser zeitaufwändige Assay dauert 4 bis 6 Wochen, erfordert viel Platz im Labor und im Inkubator, hat hohe Reagenzienkosten und ist anfällig für Kontaminationen. Hier beschreiben wir eine optimierte Methode zur Koloniezählung, die Mikro-KBE (mCFU), die eine einfache und schnelle Lösung zur Analyse der Wirksamkeit von M.tb-Impfstoffen bietet. Der mCFU-Assay benötigt zehnmal weniger Reagenzien, verkürzt die Inkubationszeit um das Dreifache und dauert 1 bis 2 Wochen, reduziert den Platzbedarf im Labor und die Reagenzienkosten und minimiert die Gesundheits- und Sicherheitsrisiken, die mit der Arbeit mit einer großen Anzahl von M.tb verbunden sind. Um die Wirksamkeit eines Tuberkuloseimpfstoffs zu bewerten, können Proben aus einer Vielzahl von Quellen entnommen werden, einschließlich Gewebe von geimpften Tieren, die mit Mykobakterien infiziert sind. Wir beschreiben auch eine optimierte Methode zur Herstellung einer einzelligen, einheitlichen und qualitativ hochwertigen Mykobakterienkultur für Infektionsstudien. Schließlich schlagen wir vor, dass diese Methoden universell für präklinische Studien zur Bestimmung der Wirksamkeit von Impfstoffen eingesetzt werden sollten, was letztendlich zu einer Zeitverkürzung bei der Entwicklung von Impfstoffen gegen TB führt.

Einleitung

Tuberkulose (TB) ist weltweit die häufigste Todesursache durch einen einzigen Infektionserreger, das Bakterium Mycobacterium tuberculosis (M.tb), das mehr Menschen tötet als jeder andere Krankheitserreger. Im Jahr 2021 war Tuberkulose für 1,6 Millionen Todesfälle verantwortlich und wurde während der Pandemie 2019-2021 von COVID-19 übertroffen¹. Darüber hinaus war laut dem globalen TB-Bericht der Weltgesundheitsorganisation von 2022 die COVID-19-Pandemie für einen Anstieg der neuen TB-Fälle verantwortlich. Die WHO berichtet auch von einem starken Rückgang der Zahl der Menschen, bei denen in diesem Zeitraum Tuberkulose diagnosti....

Protokoll

HINWEIS: Das hier beschriebene Protokoll gilt für BCG, kann aber auf alle Mykobakterien angewendet werden. BCG kann als Ersatzbakterium für TB-Experimente verwendet werden, wenn BSL3-Einrichtungen nicht verfügbar sind²². Die folgenden Verfahren unter Verwendung von BCG sollten in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 (BSL2) durchgeführt werden und den entsprechenden Biosicherheitsrichtlinien und der guten Laborpraxis für die Manipulation von Mikroorganismen der Gefahrengruppe 2 entsprechen.

1. Vorbereitung der Nährmedien

1. Bereiten Sie Middlebrook 7H9-Brühe zu, die mit 10% (v/v) Ölsäure, Albu....

Diskussion

Tuberkulose ist ein wichtiges Problem der öffentlichen Gesundheit, das vor allem in Ländern mit niedrigem und mittlerem Einkommen zunehmend an Bedeutung gewinnt. Die Unterbrechung der Gesundheitseinrichtungen zur Diagnose und Behandlung von Tuberkulose während der COVID-19-Pandemie wirkte sich negativ auf die Inzidenz neuer Fälle aus¹. Darüber hinaus müssen die multiresistenten und extensiv resistenten M.tb-Stämme und die Koinfektion von M.tb und HIV dringend angegangen we.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plates	VWR	734-2781
DSLR 15-55 mm lens	Nikon	AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR
DSLR camera	Nikon	D3400
DSLR macro lens	Sigma	MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM
Fetal calf serum	Gibco	10270106
Fiji Software		https://fiji.sc/	Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included.
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	18896
L-glutamine	Gibco	25030-081
Middlebrook 7H10	BD	262710
Middlebrook 7H9	BD	271310
Multichannel pipette (0.5 - 10 µl)	Gilson	FA10013
Multichannel pipette (20 - 200 µl)	Gilson	FA10011
Mycobacterium bovis BCG	American Type Culture Collection	ATCC35734	strain TMC 1011 [BCG Pasteur]
OADC enrichment	BD	211886
Phosphate buffered saline (PBS)	NZYTech	MB25201
RPMI 1640 medium	Gibco	21875091
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Spectrophotometer UV-6300PC	VWR	634-6041
Square Petri dish 120 x 120 mm	Corning	BP124-05
Tyloxapol	Sigma-Aldrich	T8761
Ultrasound bath Elma P 30 H	VWR	142-0051