결핵에 대한 백신의 효능 평가를 위한 Micro-colony Forming Unit Assay

요약

콜로니 형성 단위(CFU)의 측정은 눈에 보이는 콜로니를 형성하는 데 몇 주가 걸릴 수 있는 Mycobacterium tuberculosis를 포함하여 박테리아를 정량화하기 위한 황금 표준 기술입니다. 여기서는 시간 효율성 향상, 실험실 공간 및 시약 비용 절감, 중간 및 고처리량 실험으로의 확장성을 갖춘 CFU 측정을 위한 마이크로 CFU에 대해 설명합니다.

초록

전 세계적으로 감염원에 의한 주요 사망 원인인 결핵(TB)은 2022년에 160만 명의 목숨을 앗아갔으며, 2019-2021년 팬데믹 기간 동안 COVID-19를 능가했습니다. 이 질병은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis , M.tb)에 의해 발생합니다. 유일한 결핵 백신인 Mycobacterium bovis 균주 Bacillus Calmette-Guérin(BCG)은 세계에서 가장 오래된 허가 백신으로 여전히 사용되고 있습니다. 현재 12개의 백신이 임상시험 중이며 수십 개의 백신이 전임상 개발 중입니다. 전임상 연구에서 결핵 백신의 효능을 평가하기 위해 사용되는 방법은 콜로니 형성 단위(CFU) 분석에 의한 박테리아 콜로니의 계수입니다. 이 시간 소모적인 분석은 결론을 내리는 데 4-6주가 걸리고, 상당한 실험실 및 인큐베이터 공간이 필요하며, 시약 비용이 높고, 오염되기 쉽습니다. 여기서는 M.tb 백신 효능 결과를 분석하기 위한 간단하고 빠른 솔루션을 제공하는 콜로니 계수에 최적화된 방법인 micro-CFU(mCFU)에 대해 설명합니다. mCFU 분석은 10배 적은 시약이 필요하고, 배양 기간을 3배 단축하며, 결론을 내리는 데 1-2주가 소요되며, 실험실 공간 및 시약 비용을 줄이고, 많은 수의 M.tb 작업과 관련된 건강 및 안전 위험을 최소화합니다. 또한, 결핵 백신의 효능을 평가하기 위해 마이코박테리아에 감염된 백신을 접종한 동물의 조직을 포함하여 다양한 출처에서 샘플을 얻을 수 있습니다. 또한 감염 연구를 위해 단세포, 균일 및 고품질 마이코박테리아 배양을 생산하는 최적화된 방법을 설명합니다. 마지막으로, 우리는 이러한 방법이 백신 효능 결정에 대한 전임상 연구에 보편적으로 채택되어 궁극적으로 결핵 백신 개발 시간을 단축해야 한다고 제안합니다.

서문

결핵(TB)은 단일 감염원인인 결 핵균(M.tb)에 의한 전 세계 주요 사망 원인으로, 다른 어떤 병원체보다 더 많은 사람을 사망에 이르게 합니다. 2021년 결핵은 160만 명의 사망자를 발생시켰으며, 2019-2021년 팬데믹 기간 동안 코로나19를 능가했습니다¹. 또한 세계보건기구(WHO)의 2022년 전 세계 결핵 보고서에 따르면 코로나19 팬데믹으로 인해 새로운 결핵 사례가 증가했습니다. 세계보건기구(WHO)는 또한 이 기간 동안 결핵 진단을 받은 사람의 수가 크게 감소했다고 보고하고 있으며, 이로 인해 결핵 발병 건수는 더 증가할 수 있다¹.

BCG(Bacillus Calmette-Guérin)는 100여 년 전에 백신으로 처음 사용된 병원성 Mycobacterium bovis의 약독화 생균주입니다. 이 백신은 결핵에 대한 유일한 백신이며 세계에서 가장 오래된 허가된 백신으로 여전히 사용되고 있습니다 ^2,3. 현재 12개의 백신이 서로 다른 임상시험 단계에 있으며^4....

프로토콜

참고: 여기에 설명된 프로토콜은 BCG용이지만 모든 마이코박테리아에 적용할 수 있습니다. BCG는 BSL3 시설을 이용할 수 없을 때 결핵 실험을 위한 대리 세균으로 사용될 수 있다²². BCG를 사용하는 다음 절차는 생물 안전 레벨 2 (BSL2) 실험실에서 수행해야하며 위험 그룹 2 미생물 조작에 대한 적절한 생물 안전 지침 및 우수 실험실 관행을 따라야합니다.

1. 배양액 준비

1. 공급업체의 지침에 따라 7%(v/v) 올레산, 알부민, 덱스트로오스 및 카탈라아제(OADC) 농축이 보충된 Middlebrook 9H10 육수를 준비합니다. 육수에 0.05%(v/v)의 타이록사폴을 보충합니다.
   참고: Tyloxapol은 박테리아 덩어리 형성을 방지하기 위해 계면활성제로 사용된 비이온성 액체 폴리머입니다¹⁶.
2. 공급업체의 지침에 따라 7%(v/v) OADC 농축이 보충된 Middlebrook 10H10 고체 배지를 준비합니다.
3. 정사각형 페트리 접시(120mm x 120mm)당 40mL의 배지를 분배합니다. 한천 표면의 응결을 최소화하기 위해 플레이트를 건조시키십시오.
   알림....

토론

결핵은 특히 저소득 및 중간 소득 국가에서 그 중요성이 커지고 있는 중요한 공중 보건 문제입니다. COVID-19 팬데믹 기간 동안 결핵을 진단하고 치료하기 위한 의료 환경의 붕괴는 신규 사례 발생률에 부정적인 영향을 미쳤습니다¹. 또한, 이 전염병을 통제하기 위해서는 다제내성 및 광범위한 약물 내성 M.tb 균주, M.tb와 HIV의 동시 감염이 시급히 해결되어야 한다

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plates	VWR	734-2781
DSLR 15-55 mm lens	Nikon	AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR
DSLR camera	Nikon	D3400
DSLR macro lens	Sigma	MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM
Fetal calf serum	Gibco	10270106
Fiji Software		https://fiji.sc/	Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included.
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	18896
L-glutamine	Gibco	25030-081
Middlebrook 7H10	BD	262710
Middlebrook 7H9	BD	271310
Multichannel pipette (0.5 - 10 µl)	Gilson	FA10013
Multichannel pipette (20 - 200 µl)	Gilson	FA10011
Mycobacterium bovis BCG	American Type Culture Collection	ATCC35734	strain TMC 1011 [BCG Pasteur]
OADC enrichment	BD	211886
Phosphate buffered saline (PBS)	NZYTech	MB25201
RPMI 1640 medium	Gibco	21875091
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Spectrophotometer UV-6300PC	VWR	634-6041
Square Petri dish 120 x 120 mm	Corning	BP124-05
Tyloxapol	Sigma-Aldrich	T8761
Ultrasound bath Elma P 30 H	VWR	142-0051