Ensayo de la unidad formadora de microcolonias para la evaluación de la eficacia de las vacunas contra la tuberculosis

Resumen

La determinación de las unidades formadoras de colonias (UFC) es la técnica de referencia para cuantificar las bacterias, incluida la Mycobacterium tuberculosis , que puede tardar semanas en formar colonias visibles. Aquí describimos una micro-UFC para la determinación de UFC con mayor eficiencia de tiempo, menor espacio de laboratorio y costo de reactivos, y escalabilidad a experimentos de rendimiento medio y alto.

Resumen

La tuberculosis (TB), la principal causa de muerte en todo el mundo por un agente infeccioso, mató a 1,6 millones de personas en 2022, solo superada por la COVID-19 durante la pandemia de 2019-2021. La enfermedad es causada por la bacteria Mycobacterium tuberculosis (M.tb). La cepa de Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), la única vacuna contra la tuberculosis, es la vacuna autorizada más antigua del mundo, todavía en uso. Actualmente, hay 12 vacunas en ensayos clínicos y docenas de vacunas en desarrollo preclínico. El método de elección utilizado para evaluar la eficacia de las vacunas contra la tuberculosis en estudios preclínicos es la enumeración de las colonias bacterianas mediante el ensayo de unidades formadoras de colonias (UFC). Este ensayo, que requiere mucho tiempo, tarda entre 4 y 6 semanas en concluir, requiere un espacio considerable en el laboratorio y la incubadora, tiene altos costes de reactivos y es propenso a la contaminación. Aquí describimos un método optimizado para la enumeración de colonias, la micro-UFC (mCFU), que ofrece una solución simple y rápida para analizar los resultados de eficacia de la vacuna M.tb . El ensayo mCFU requiere diez veces menos reactivos, reduce el período de incubación tres veces, tardando de 1 a 2 semanas en concluir, reduce el espacio de laboratorio y el costo de los reactivos, y minimiza los riesgos para la salud y la seguridad asociados con el trabajo con grandes cantidades de M.tb. Además, para evaluar la eficacia de una vacuna contra la tuberculosis, se pueden obtener muestras de diversas fuentes, incluidos tejidos de animales vacunados infectados con micobacterias. También describimos un método optimizado para producir un cultivo de micobacterias unicelular, uniforme y de alta calidad para estudios de infección. Por último, proponemos que estos métodos se adopten universalmente para los estudios preclínicos de determinación de la eficacia de las vacunas, lo que en última instancia conducirá a una reducción del tiempo en el desarrollo de vacunas contra la tuberculosis.

Introducción

La tuberculosis (TB) es la principal causa de muerte en todo el mundo por un solo agente infeccioso, la bacteria Mycobacterium tuberculosis (M.tb), que mata a más personas que cualquier otro patógeno. En 2021, la tuberculosis fue responsable de 1,6 millones de muertes y fue superada por la COVID-19 durante la pandemia de 2019-2021¹. Además, según el informe mundial sobre la tuberculosis de 2022 de la Organización Mundial de la Salud, la pandemia de COVID-19 fue responsable de un aumento de los nuevos casos de tuberculosis. La OMS también informa de grandes descensos en el número de personas diagnosticadas con tuberculosis dura....

Protocolo

NOTA: El protocolo descrito aquí es para BCG, pero se puede aplicar a cualquier micobacteria. La BCG puede utilizarse como bacteria sustituta para experimentos de tuberculosis cuando no se dispone de instalaciones BSL3²². Los siguientes procedimientos con BCG deben realizarse en un laboratorio de nivel de bioseguridad 2 (BSL2) y seguir las directrices de bioseguridad y las buenas prácticas de laboratorio adecuadas para la manipulación de microorganismos del grupo de riesgo 2.

1. Preparación de los medios de cultivo

1. Prepare el caldo Middlebrook 7H9 suplementado con enriquecimiento de ácido o....

Discusión

La tuberculosis es un importante problema de salud pública con una importancia creciente, especialmente en los países de ingresos bajos y medios. La interrupción de los entornos sanitarios para diagnosticar y tratar la tuberculosis durante la pandemia de COVID-19 tuvo un impacto negativo en la incidencia de nuevos casos¹. Además, las cepas de M.tb multirresistentes y ampliamente resistentes, así como la coinfección de M.tb y VIH, deben abordarse con urgencia para controlar .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plates	VWR	734-2781
DSLR 15-55 mm lens	Nikon	AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR
DSLR camera	Nikon	D3400
DSLR macro lens	Sigma	MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM
Fetal calf serum	Gibco	10270106
Fiji Software		https://fiji.sc/	Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included.
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	18896
L-glutamine	Gibco	25030-081
Middlebrook 7H10	BD	262710
Middlebrook 7H9	BD	271310
Multichannel pipette (0.5 - 10 µl)	Gilson	FA10013
Multichannel pipette (20 - 200 µl)	Gilson	FA10011
Mycobacterium bovis BCG	American Type Culture Collection	ATCC35734	strain TMC 1011 [BCG Pasteur]
OADC enrichment	BD	211886
Phosphate buffered saline (PBS)	NZYTech	MB25201
RPMI 1640 medium	Gibco	21875091
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Spectrophotometer UV-6300PC	VWR	634-6041
Square Petri dish 120 x 120 mm	Corning	BP124-05
Tyloxapol	Sigma-Aldrich	T8761
Ultrasound bath Elma P 30 H	VWR	142-0051