用于结核病疫苗功效评估的微集落形成单位测定

摘要

菌落形成单位 （CFU） 的测定是定量细菌的金标准技术，包括 结核分枝杆菌，结核分枝杆 菌可能需要数周时间才能形成可见菌落。在这里，我们描述了一种用于 CFU 测定的微型 CFU，它提高了时间效率，减少了实验室空间和试剂成本，并可扩展到中高通量实验。

摘要

结核病 （TB） 是全球传染性病原体导致死亡的主要原因，2022 年造成 160 万人死亡，仅在 2019-2021 年大流行期间被 COVID-19 超越。该病由 结核分枝杆菌 （M.tb）引起。 牛分枝杆菌 卡介苗（BCG）是唯一的结核病疫苗，是世界上获得许可的最古老的疫苗，仍在使用。目前，有12种疫苗处于临床试验阶段，数十种疫苗处于临床前开发阶段。在临床前研究中，用于评估结核病疫苗疗效的首选方法是通过菌落形成单位 （CFU） 测定法对细菌菌落进行计数。这种耗时的检测需要 4 到 6 周才能完成，需要大量的实验室和培养箱空间，试剂成本高，并且容易受到污染。在这里，我们描述了一种优化的菌落计数方法，即微 CFU （mCFU），它为分析 结核分枝杆 菌疫苗的功效结果提供了一种简单而快速的解决方案。mCFU 检测所需的试剂数量减少了 10 倍，潜伏期缩短了 3 倍，需要 1 到 2 周才能完成，减少了实验室空间和试剂成本，并将与大量 M.tb 相关的健康和安全风险降至最低。此外，为了评估结核病疫苗的功效，可以从各种来源获得样本，包括感染分枝杆菌的接种疫苗动物的组织。我们还描述了一种优化的方法，用于感染研究生产单细胞、均匀和高质量的分枝杆菌培养物。最后，我们建议将这些方法普遍用于疫苗功效测定的临床前研究，最终缩短结核病疫苗开发的时间。

引言

结核病（TB）是全球单一传染性病原体结 核分枝杆菌 （M.tb）死亡的主要原因，其死亡人数超过任何其他病原体。2021年，结核病导致160万人死亡，在2019-2021年大流行期间被COVID-19超过¹。此外，根据世界卫生组织的 2022 年全球结核病报告，COVID-19 大流行是导致新发结核病病例增加的原因。世卫组织还报告说，在此期间，被诊断患有结核病的人数大幅下降，这可能会进一步增加结核病病例数¹。

卡介苗 （BCG） 是致病性牛分枝杆菌的减毒活菌株，100 多年前首次用作疫苗。这是唯一的结核病疫苗，也是世界上仍在使用的最古老的许可疫苗^2,3。目前，有 12 种疫苗处于临床试验的不同阶段⁴，数十种疫苗正在临床前开发^{中 5,6}。结核病疫苗的临床前评估包括安全性和免疫原性评估⁷，这可以在斑马鱼、小鼠、豚鼠、兔子、牛和非人灵长类动物等各种动物模型中获得 ^8,9,10

研究方案

注意：此处描述的方案适用于BCG，但可以应用于任何分枝杆菌。当 BSL3 设施不可用时，BCG 可用作结核病实验的替代细菌²².使用卡介苗的以下程序应在生物安全 2 级 （BSL2） 实验室下进行，并遵循适当的生物安全指南和操作危险组 2 微生物的良好实验室规范。

1. 培养基制备

1. 根据供应商的说明，准备补充有 10% （v/v） 油酸、白蛋白、葡萄糖和过氧化氢酶 （OADC） 富集的 Middlebrook 7H9 肉汤。用 0.05% （v/v） 的泰洛沙泊补充肉汤。
   注意：Tyloxapol 是一种非离子液体聚合物，已用作表面活性剂以防止细菌团块形成¹⁶.
2. 根据供应商的说明制备补充有10%（v / v）OADC富集的Middlebrook 7H10固体培养基。
3. 每个方形培养皿 （120 mm x 120 mm） 分配 40 mL 培养基。让平板干燥，以尽量减少琼脂表面的冷凝。
   注意：这种特定尺寸的培养皿对于允许从 96 孔板直接转座至少 96 个液滴至关重要。板的有效干燥将促进细菌悬浮液小液滴的电镀，并防止液滴扩散。
4. 制备 Roswell Park Memorial Institute 培养基 （RPMI 1640） 或 Dulbecco 改良 Eag....

讨论

结核病是一个重要的公共卫生问题，其重要性日益增加，特别是在低收入和中等收入国家。在COVID-19大流行期间，诊断和治疗结核病的医疗机构中断，对^新发病例的发病率产生了负面影响1。此外，必须紧急解决多药和广泛耐药的结核分枝杆菌菌株以及结核分枝杆菌和艾滋病毒的合并感染，以控制这一流行病^1,34。替代或改?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plates	VWR	734-2781
DSLR 15-55 mm lens	Nikon	AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR
DSLR camera	Nikon	D3400
DSLR macro lens	Sigma	MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM
Fetal calf serum	Gibco	10270106
Fiji Software		https://fiji.sc/	Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included.
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	18896
L-glutamine	Gibco	25030-081
Middlebrook 7H10	BD	262710
Middlebrook 7H9	BD	271310
Multichannel pipette (0.5 - 10 µl)	Gilson	FA10013
Multichannel pipette (20 - 200 µl)	Gilson	FA10011
Mycobacterium bovis BCG	American Type Culture Collection	ATCC35734	strain TMC 1011 [BCG Pasteur]
OADC enrichment	BD	211886
Phosphate buffered saline (PBS)	NZYTech	MB25201
RPMI 1640 medium	Gibco	21875091
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Spectrophotometer UV-6300PC	VWR	634-6041
Square Petri dish 120 x 120 mm	Corning	BP124-05
Tyloxapol	Sigma-Aldrich	T8761
Ultrasound bath Elma P 30 H	VWR	142-0051