تصوير الخلايا الحية لذبابة الفاكهة الميلانوجاستر أدمغة اليرقات الثالثة

Summary

هنا ، نناقش سير العمل لإعداد وتشريح وتركيب وتصوير أدمغة الزرع الحية من يرقات ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر الثالثة لمراقبة الديناميكيات الخلوية ودون الخلوية في ظل الظروف الفسيولوجية.

Abstract

تخضع الخلايا الجذعية العصبية ذبابة الفاكهة (الخلايا العصبية ، NBs فيما بعد) لانقسامات غير متماثلة ، مما يؤدي إلى تجديد الخلايا العصبية ذاتية التجديد ، بينما تشكل أيضا خلية أم متمايزة (GMC) ، والتي ستخضع لتقسيم إضافي واحد ليؤدي إلى ظهور خليتين عصبيتين أو دبقية. كشفت الدراسات في NBs عن الآليات الجزيئية الكامنة وراء قطبية الخلية ، واتجاه المغزل ، والتجديد الذاتي للخلايا الجذعية العصبية ، والتمايز. يمكن ملاحظة هذه الانقسامات الخلوية غير المتماثلة بسهولة عن طريق تصوير الخلايا الحية ، مما يجعل اليرقات NBs مناسبة بشكل مثالي للتحقيق في الديناميات الزمانية المكانية لانقسام الخلايا غير المتماثل في الأنسجة الحية. عند تشريحها وتصويرها بشكل صحيح في وسط مكمل بالمغذيات ، تنقسم NBs في أدمغة الزرع بقوة لمدة 12-20 ساعة. الأساليب الموصوفة سابقا صعبة تقنيا وقد تشكل تحديا لأولئك الجدد في هذا المجال. هنا ، يتم وصف بروتوكول لإعداد وتشريح وتركيب وتصوير نباتات دماغ اليرقات الحية الثالثة باستخدام مكملات الجسم الدهنية. كما تتم مناقشة المشاكل المحتملة ، ويتم تقديم أمثلة لكيفية استخدام هذه التقنية.

Introduction

انقسام الخلايا غير المتماثل (ACD) هو العملية التي يتم من خلالها تقسيم المكونات تحت الخلوية مثل الحمض النووي الريبي والبروتينات والعضيات بشكل غير متساو بين الخلايا الوليدة ^1,2. تظهر هذه العملية بشكل شائع في الخلايا الجذعية ، التي تخضع ل ACD لتؤدي إلى ظهور خلايا ابنة ذات مصائر تنموية مختلفة. ذبابة الفاكهة تنقسم NBs بشكل غير متماثل لإنتاج NB واحد ، والذي يحتفظ بجذعه ، وخلية أم واحدة (GMC). يخضع GMC لمزيد من الانقسامات لإنتاج الخلايا العصبية المتمايزة أو الدبقية³. NBs المقسمة بشكل غير متماثل وفيرة في الأدمغة النامية لليرقات الثالثة ، والتي يمكن ملاحظتها بسهولة عن طريق الفحص المجهري. في المرحلة الثالثة من اليرقات الداخلية ، يوجد ما يقرب من 100 NBs في كل فص دماغي مركزي³،^4،5،6.

انقسام الخلايا غير المتماثل هو عملية ديناميكية للغاية. تم استخدام بروتوكولات تصوير الخلايا الحية لقياس وقياس ديناميكيات قطبية الخلية⁷،⁸،⁹،10 ، اتجاه المغزل 11،12،13 ، ديناميات قشرة الأكتوميوسين 14،15،16،^17،18 ، الأنابيب الدقيقة وبيولوجيا الجسيم المركزي ^19،20، 21،²²،23،24،25،26،27 ، والغشاء^10،28 وديناميات الكروماتين ²⁹. تعتمد الأوصاف النوعية والكمية ل ACD على طرق وبروتوكولات قوية لتقسيم NBs في أدمغة حية سليمة. يحدد البروتوكول التالي طرق تحضير وتشريح وتصوير أدمغة اليرقات الثالثة لتصوير الخلايا الحية في الجسم الحي باستخدام طريقتين مختلفتين للتركيب. هذه الطرق هي الأنسب للباحثين المهتمين بالديناميكيات الزمانية المكانية لانقسامات الخلايا الجذعية ، وكذلك الانقسامات في خلايا الدماغ الأخرى ، لأنها تسمح بمراقبة الأحداث الخلوية على المدى القصير والطويل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن الوصول بسهولة إلى هذه التقنيات للقادمين الجدد إلى هذا المجال. لقد أثبتنا فعالية هذا النهج وقدرته على التكيف مع أدمغة اليرقات التي تعبر عن الأنابيب الدقيقة الموسومة بالفلورسنت وبروتينات الاندماج القشري. بالإضافة إلى ذلك ، نناقش طرق التحليل واعتبارات التطبيق في دراسات أخرى.

Protocol

ملاحظة: يوضح الشكل 1 المواد المطلوبة لإجراء هذه الدراسة.

1. الاعتبارات والاستعدادات للتجربة

1. منع اليرقات من الاكتظاظ.
   ملاحظة: ترتبط جودة أدمغة اليرقات المزروعة ارتباطا مباشرا بصحة وجودة اليرقات قبل التشريح. اليرقات التي تعاني من سوء التغذية من الاكتظاظ ستنتج عموما أدمغة أقل جودة³⁰.
   1. تأكد من عدم وجود أكثر من 20-30 يرقة لكل طبق غطاء وجبة لتجنب سوء التغذية. يمكن رؤية أمثلة على ذلك في الشكل 2.
2. تصفية و aliquot شنايدر المتوسطة قبل الاستخدام.
   1. لكل تشريح ، قم بإعداد وسط تصوير وتشريح جديد عن طريق استكمال وسط الحشرات من شنايدر المقتبس بمصل نمو الأبقار بنسبة 1٪ (BGS). عادة ما يكون حجم 5 مل من التشريح ووسط التصوير كافيا لتجربة التصوير.
   2. قم بتسخين الوسط المكمل إلى درجة حرارة الغرفة (RT) قبل الاستخدام.
3. ضع في اعتبارك طول الفيلم المراد جمعه ، واستخدم ذلك لمراعاة مكملات وسيط التصوير ، ونهج التركيب ، وإعدادات اكتساب المجهر.
   ملاحظة: في ظل الظروف المثلى ، فإن NBs في الأدمغة المكملة ب BGS فقط سوف تنقسم بقوة لما يزيد عن 3 ساعات.
   1. استكمل وسط التصوير عن طريق إضافة أنسجة الجسم الدهنية اليرقية إلى وسط التصوير لدعم الانقسامات بعد 4 ساعات عند إجراء التجارب التي تتطلب أفلاما أطول.
      ملاحظة: تفرز الأجسام الدهنية الميتوجينات التي تدعم انتشار NB³¹ ، والأجسام الدهنية الكاملة من 10 يرقات كافية لدعم أربعة إلى خمسة أدمغة. علاوة على ذلك ، تبين أن العينات المصورة بشريحة محاطة بغشاء تنقسم لأكثر من 10 ساعات^13,32 ، في حين أن العينات المصورة بشريحة متعددة الآبار عادة ما تنقسم بشكل أقل (ملاحظات غير منشورة).
   2. بدلا من ذلك ، قم بتنفيذ وسيط تصوير أكثر تعقيدا للأفلام الطويلة ، كما هو موضح سابقا³³. قلل التلف الضوئي عن طريق ضبط وقت التعرض وطاقة الليزر وتكرار أخذ العينات للحصول على أفضل النتائج.

2. تنظيم اليرقات وجمعها (الشكل 2)

1. عبور الذباب البكر البالغ من العمر 1-5 أيام مع الذباب الذكور البالغين البالغ من العمر 1-7 أيام لإنتاج ذرية مع النمط الوراثي المطلوب. للحصول على العائد الأمثل ، عبر 10-15 عذراء الإناث مع 5-10 الذكور. قم بإيداع هذه الذباب في قفص ذباب مع غطاء وجبة (الشكل 2A-C) ، واحتضانها عند 25 درجة مئوية.
2. استبدل غطاء الوجبة يوميا. هذا يمنع أغطية الوجبات من أن تصبح مكتظة باليرقات ، مما يقلل من جودة الأدمغة المشرحة.
3. إذا كان غطاء الوجبة مغطى بشكل كبير باليرقات (أي >30) ، فقم بتقسيم غطاء الوجبة هذا إلى نصفين ، واستبدل النصف بغطاء وجبة طازج تم قطعه أيضا إلى النصف. بدلا من ذلك ، قم بتبديل أغطية الوجبات على أساس أكثر تكرارا (أي كل 12 ساعة بدلا من كل 24 ساعة). يمكن رؤية أمثلة على أغطية الوجبات المكتظة بالسكان في الشكل 2E ، F.
4. احتضان غطاء الوجبة مع اليرقات عند 25 درجة مئوية حتى تصل اليرقات إلى العمر المطلوب.

3. تشريح الجسم الدهني اليرقات (الشكل 3)

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول التشريح باستخدام طبق تشريح 3 آبار.

1. ماصة ~ 400 ميكرولتر من التشريح والتصوير المتوسط في كل بئر من طبق تشريح 3 آبار.
2. اغسل عشرة يرقات من النوع البري عمرها 72-96 ساعة جيدة التغذية عن طريق إمساكها برفق بملقط تشريح وغمسها داخل وخارج محلول التشريح في قاع البئر حتى يتم غسل جميع جسيمات الطعام. بعد الشطف ، انقل اليرقات النظيفة إلى البئر الأوسط.
3. باستخدام مجموعة واحدة من الملقط ، أمسك اليرقة بواسطة خطافات الفم. مع المجموعة الأخرى من الملقط ، تمزق جانب واحد من بشرة اليرقة.
4. سيؤدي هذا التمزق إلى تسرب الأجسام الدهنية من اليرقة. الأجسام الدهنية بيضاء اللون وشبه شفافة وسيكون لها بنية تشبه الشبكة (الشكل 3I). تميل الأجسام الدهنية أيضا إلى التمسك بنفسها وملاقط التشريح. بمجرد التعرف عليها ، اجمع أكبر قدر ممكن من الجسم الدهني من كل يرقة ، وانقله بالملقط إلى أعلى بئر باستخدام 400 ميكرولتر من وسط تشريح RT.

4. تشريح دماغ اليرقات (الشكل 3)

1. اغسل اليرقات التجريبية في وسط التشريح والتصوير على النحو الوارد أعلاه لتحريرها من بقايا الطعام. للحصول على أفضل النتائج ، تجنب تخزين اليرقات غير المشرحة في محلول التشريح. سيؤدي ذلك إلى "غرق" اليرقات وسيؤثر سلبا على جودة الأدمغة المشرحة.
2. باستخدام مجموعة واحدة من الملقط ، أمسك اليرقة بواسطة خطافات الفم. باستخدام مجموعة أخرى من الملقط ، قم بقص / تمزيق ما يقرب من 1/3 من اليرقة برفق من الجانب الخلفي (الشكل 3 أ). سيؤدي ذلك إلى "انفجار" عناصر الجهاز الهضمي والأجسام الدهنية والنسيج الضام والجهاز العصبي من الجانب الممزق من اليرقة (الشكل 3 ب).
3. باستخدام مجموعة واحدة من الملقط ، أمسك اليرقة بواسطة خطافات الفم. باستخدام المجموعة الأخرى من الملقط ، قم بتنظيف البشرة برفق نحو خطافات الفم أثناء "الدفع" للداخل باستخدام الملقط الذي يمسك خطافات الفم حتى يتم قلب اليرقة بأكملها من الداخل للخارج. تشبه هذه الحركة قلب جورب "من الداخل إلى الخارج" (الشكل 3C ، D).
4. اقلب اليرقة بحيث يواجه الجهاز العصبي المركزي والأنسجة الأخرى الخارج بينما لا يزال متصلا بالبشرة. في هذه الخطوة ، حدد موقع الجهاز العصبي المركزي (CNS) لتجنب الإزالة العرضية. باستخدام الملقط ، قم بإزالة جميع الأنسجة غير الموجودة في الجهاز العصبي المركزي برفق ، مع ترك الجهاز العصبي المركزي والدماغ فقط متصلين بالبشرة (الشكل 3E).
5. سيتم ربط الدماغ بالبشرة عبر الوصلات المحورية. باستخدام مقص التشريح المجهري ، قم بقطع هذه الوصلات المحورية لتحرير الدماغ من البشرة. للقيام بذلك ، قم أولا بقص بلطف تحت فصوص الدماغ (الشكل 3F). كرر مع الوصلات تحت الحبل العصبي البطني.
   ملاحظة: يمكن إجراء هذه الخطوة باستخدام الملقط إذا لم يكن مقص التشريح الدقيق متاحا. توخ الحذر بشكل خاص عند استخدام الملقط للتأكد من أن أنسجة المخ لا تتمدد بشكل مفرط أثناء إزالتها من البشرة لأن الإجهاد الميكانيكي سيؤثر سلبا على صحة الدماغ.
6. نقل الدماغ تشريح إلى بئر مع تشريح ووسط التصوير. لتجارب التصوير التي تزيد مدتها عن 3 ساعات ، استخدم التشريح ووسط التصوير المكمل بالأجسام الدهنية كما هو موضح أعلاه. تشريح اليرقات على دفعات للحفاظ على وقت التشريح أقل من 20 دقيقة.

5. التركيب والتصوير (الشكل 4)

1. للتصوير باستخدام شريحة محاطة بالغشاء³⁴:
   1. اجمع كل من العقول المشرحة والأجسام الدهنية المعزولة في البئر الأخير من طبق التشريح.
   2. قم بتجميع نصف الشريحة عن طريق وضع غشاء منفذ للغاز فوق الجزء الخلفي من الشريحة ، واضغط على الحلقة المنقسمة في المنتصف ، وثبتها في مكانها (الشكل 4A-C).
   3. باستخدام ميكروماصة 200 ميكرولتر ، قم بنقل ما يصل إلى 10 أدمغة تشريح وأكبر قدر ممكن من الجسم الدهني (انظر أعلاه) في ~ 130-140 ميكرولتر من التشريح والتصوير المتوسط إلى الغشاء. تأكد من إيداع الوسط مع العينات في وسط الغشاء المنفذ للغاز (الشكل 4D ، E).
   4. توجيه الأدمغة لسكان NBs ليتم تصويرهم ونوع المجهر المستخدم (الشكل 4E). ضع العينة بالقرب من هدف المجهر قدر الإمكان. على سبيل المثال ، لتصوير NBs في فصوص الدماغ المركزية ، قم بتوجيه الأدمغة بحيث تكون فصوص الدماغ أقرب إلى الهدف (الشكل 4H).
   5. بمجرد توجيه الأدمغة ، ضع غطاء زجاجي برفق فوق المحلول على الغشاء. سيؤدي ذلك إلى انتشار المحلول الذي يحتوي على الأدمغة والأجسام الدهنية على كامل الغشاء (الشكل 4F).
   6. لطخة الحل المفرط عن طريق عقد الأنسجة المختبرية بالقرب من حافة الغطاء. يتم تحقيق الكمية المثلى من المحلول عندما تلمس الأدمغة غطاء الغطاء دون أن يتم سحقها. إذا كانت إعادة التوجيه مطلوبة في هذه الخطوة ، فقم بتحريك غطاء الغطاء بعناية لتحريك الأدمغة.
   7. شل حركة الغطاء عن طريق وضع هلام البترول المذاب على طول حواف غطاء الغطاء باستخدام فرشاة الرسم. اسمح للهلام بالتصلب (الشكل 4 ز).
2. للتصوير باستخدام شريحة تصوير متعددة الآبار (الشكل 4):
   1. أضف 400 ميكرولتر من وسيط التصوير إلى بئر من شريحة متعددة الآبار (في التجربة التي أجريت هنا ، تم استخدام شريحة صغيرة ذات 8 آبار [μ] ؛ الشكل 4I). نقل الأجسام الدهنية التي تم تشريحها سابقا إلى هذا البئر (انظر الخطوة 3.4).
   2. قم بإيداع ما يصل إلى 10 أدمغة في مجموعة بالقرب من مركز البئر (الشكل 4J).
   3. قم بتوجيه الأدمغة لسكان NBs ليتم تصويرهم ولنوع المجهر المستخدم ، كما هو موضح في الخطوة 5.1.4 (الشكل 4K). رتب العينات بحيث تكون قريبة من بعضها البعض. سيؤدي ذلك إلى تقليل المسافة التي يجب أن تقطعها المرحلة بين العينات ، مما يقلل من انحراف العينة أثناء الاستحواذ.
   4. بمجرد توجيه الأدمغة في البئر ، اسمح للأدمغة بالاستقرار لمدة 2-5 دقائق. هذا يزيد من ثباتها أثناء النقل / التصوير. تحضير المجهر للاستحواذ خلال هذا الوقت.
   5. قم بتغطية الشريحة μ بغطاء الشريحة ، وانقلها إلى المجهر. ابدأ الاكتساب بأقل طاقة ليزر ووقت تعرض ممكن لتقليل التبييض الضوئي.

6. أفضل ممارسات معالجة البيانات وإدارتها

1. معالجة البيانات حسب الحاجة وفقا لبرنامج التحليل المتاح.
   1. بالنسبة للمثال الموضح هنا، احفظ البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام برنامج SlideBook كملف صورة SlideBook (.sld).
   2. للتحويل إلى نوع الملف الخاص ب Imaris (.ims) باستخدام محول ملفات Imaris ، افتح محول ملفات Imaris في نافذة منفصلة. انقر فوق ملفات .sld واسحبها إلى قسم "الإدخال" في محول ملفات Imaris.
   3. حدد موقع الإخراج المطلوب للملفات المحولة ، وانقر فوق "بدء الكل".
   4. بعد التحويل ، قم بعرض البيانات والتعليق عليها في برنامج Imaris.
      ملاحظة: يمكن استخدام بدائل لتحليل الصور بدلا من Imaris ، مثل فيجي (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html) أو Aivia (https://www.aivia-software.com/) أو Volocity (https://www.volocity4d.com/) أو غيرها.
2. احتفظ بأكبر قدر ممكن من البيانات الأصلية لحفظ السجلات بشكل صحيح. على سبيل المثال ، إذا تم حفظ برنامج الاستحواذ بتنسيق ملف واحد ولكن تم تحويله إلى تنسيق مختلف للتحليل ، فاحتفظ بالإصدار الذي تم الحصول عليه من البيانات.
3. لتحليل البيانات، احتفظ بسجل لأكبر عدد ممكن من التفاصيل حول إعدادات العينة والاستحواذ. تتضمن المعلومات الأساسية التي يجب الاحتفاظ بها النمط الوراثي لليرقات التي تم تشريحها ، وعمر اليرقات قبل التشريح ، وحالة غطاء الوجبة الذي تم تربيتها فيه ، وقوة الليزر المستخدمة أثناء التصوير ، ووقت التعرض ، وطول فترة الاكتساب ، والدقة الزمنية.

7. مثال على القياس الكمي لطول دورة الخلية (الشكل 5)

ملاحظة: في هذا المثال ، تم تصوير اليرقات التي تعبر عن دبابيس علامة القطبية (Pins::EGFP¹⁶) وبروتين Jupiter²⁵ المرتبط بالأنابيب الدقيقة (الكرز::Jupiter¹³). تم إجراء التحليل اللاحق باستخدام برنامج Imaris.

1. افتح الفيلم باستخدام برنامج تحليل الصور الذي تختاره. قم بالتمرير خلال طول الفيلم لتحديد تقسيم NBs ، وقم بتسميتها للرجوع إليها في المستقبل. حدد NBs المقسمة بواسطة مغازلها الانقسامية المميزة (الشكل 5C-E).
2. تحديد مرحلة دورة الخلية المرجعية لتحديد طول دورة الخلية. في هذا المثال ، يتم استخدام الطور الاستوائي كمرجع.
3. حدد يدويا عدد الإطارات بين الأطوار الاستوائية المتتالية، وقم بتحويلها إلى دقائق أو ساعات لتحديد الوقت المستغرق لإكمال دورة خلية واحدة.
   1. افعل ذلك عن طريق أخذ الدقة الزمنية للفيلم وضربها في عدد الإطارات بين الأطوار. على سبيل المثال ، إذا كانت الدقة الزمنية للفيلم عبارة عن إطار واحد كل 5 دقائق ، وتم ملاحظة الأطوار الاستوائية في الإطار 13 والإطار 35 ، فسيكون الوقت بين هذه الأطوار الاستوائية 110 دقيقة ([35 - 13] × 5).
4. ارسم البيانات باستخدام أي برنامج مناسب. تم رسم البيانات الموضحة هنا باستخدام برنامج PRISM.

8. مثال على القياس الكمي لمحاذاة مغزل الخلية (الشكل 5)

ملاحظة: في هذا المثال، يتم إجراء التحليل باستخدام برنامج Imaris.

1. افتح ملف الفيلم في Imaris أو برنامج آخر من اختيارك. قم بالتمرير خلال طول الفيلم لتحديد تقسيم NBs ، وقم بتسميتها للرجوع إليها في المستقبل.
2. حدد المتجه الذي يتكون من قطبي المغزل باستخدام الجسيمات المركزية القمية والقاعدية (ممثلة ب m) ، على النحو التالي:
   
   حيث Ax و Ay و Az هي إحداثيات الجسيم المركزي القمي ، و Bx و By و Bz هي إحداثيات الجسيم المركزي القاعدي. وبالمثل ، يتكون محور متجه القسمة (الممثل ب n) من نقطة منتصف الدبابيس القمية::EGFP الهلال والقشرة القاعدية:
   
   حيث الفأس و Ay و Az هي إحداثيات نقطة منتصف الدبابيس::EGFP الهلال ، و Bx و By و Bz هي إحداثيات نقطة منتصف القشرة القاعدية.
3. أوجد حجم المتجهين m و n:
   حجم م:
   مقدار n:
4. حدد حاصل الضرب النقطي (الذي يمثله k) ل m و n:
   
5. باستخدام حاصل الضرب النقطي k ومقادير المتجه m و n ، حدد الزاوية بين المتجهات:
   
6. ارسم البيانات في البرنامج الذي تختاره. تم إعداد البيانات الموضحة هنا في Microsoft Excel وتصورها في PRISM.

النتائج

تشريح وتصوير الفص الدماغي المركزي NBs معبرا عن الدبابيس::EGFP والكرز::كوكب المشتري
لعرض هذا البروتوكول ، اليرقات التي تعبر عن الكرز الذي يحركه UAS :: كوكب المشتري¹³ والمسمى داخليا الدبابيس :: EGFP¹⁶ (w ؛ worGal4 ، UAS-cherry :: jupiter / CyO ؛ تم تصوير الدبابيس :: EGFP / TM6B ، Tb) لمدة 4 س?...

Discussion

يحدد هذا البروتوكول نهجا واحدا لتصوير أدمغة النباتات الحية من يرقات ذبابة الفاكهة الميلانوجاستر . يسمح البروتوكول الموصوف هنا بمراقبة أدمغة الزرع لمدة 12-20 ساعة في ظل الظروف التجريبية المناسبة. يجب إيلاء اهتمام خاص لإعداد العينات وتصميم التجارب المطلوبة. كما ذكر أعلاه ، فإن أحد أهم ا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane	Genesee	25-231	Vacuum-driven filters
Agar	Genesee	20-248	granulated agar
Analytical Computer	Dell	NA	Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system
Bovine Growth Serum	HyClone	SH30541.02
Chambered Imaging Slides	Ibidi	80826
Confocal Microscope	Nikon	NA
Custom-machined metal slide	NA	NA	See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications
Dissection Dishes	Fisher Scientific	5024343	3-well porcelain micro spot plate
Dissection Forceps	World Precision Instruments	Dumont #5
Dissection Microscope	Leica	NA
Dissection Scissors	Fine Science Tools (FST)	15003-08
Embryo collection cage	Genesee	59-100
Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies	Genesee	59-172
Gas-permeable membrane	YSI	98095	Gas-permeable membrane
Glass Cover Slides	Electron Microscopy Sciences	72204-03	# 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips
Imaris	Oxford Instruments	NA	Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia
Imaris File Converter	Oxford Instruments	NA
Instant Yeast	Saf-Instant	NA
Molasses	Genesee	62-117
Petri dish	Greiner Bio-One	628161	60 mm x 15 mm Petri dish
Petroleum Jelly	Vaseline	NA
Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid	Millipore Sigma	S0146
SlideBook acquisition software	3i	NA
Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter	Genesee Scientific, GenClone	25-231