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本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 代表性结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

在这里,我们讨论了一种工作流程,用于准备、解剖、安装和成像来自黑 腹果蝇 第三龄幼虫的活外植体大脑,以观察生理条件下的细胞和亚细胞动力学。

摘要

果蝇 神经干细胞(神经母细胞,以下简称NBs)经历不对称分裂,再生自我更新的神经母细胞,同时还形成分化神经节母细胞(GMC),该母细胞将经历一次额外的分裂以产生两个神经元或神经胶质细胞。NBs的研究揭示了细胞极性,纺锤体取向,神经干细胞自我更新和分化的分子机制。这些不对称的细胞分裂很容易通过活细胞成像 观察到 ,使幼虫NB非常适合研究活组织中不对称细胞分裂的时空动力学。当在营养补充培养基中正确解剖和成像时,外植体大脑中的NBs强烈分裂12-20小时。前面描述的方法在技术上是困难的,对于那些刚进入该领域的人来说可能具有挑战性。在这里,描述了使用脂肪体补充剂制备、解剖、安装和成像活的三龄幼虫脑外植体的方案。还讨论了潜在的问题,并提供了如何使用这种技术的示例。

引言

不对称细胞分裂 (ACD) 是亚细胞成分(如 RNA、蛋白质和细胞器)在子细胞之间分配不均等的过程 1,2。这个过程在干细胞中很常见,干细胞经历ACD以产生具有不同发育命运的子细胞。果蝇NBs不对称地分裂以产生一个NB,保留其干性,以及一个神经节母细胞(GMC)。GMC经历进一步的分裂以产生分化的神经元或神经胶质细胞3。不对称分裂的NBs在三龄幼虫的发育大脑中很丰富,通过显微镜很容易观察到。在第三龄幼虫阶段,每个中枢脑叶中大约有100个NBs3,4,5,6。

不对称细胞分裂是一个高度动态的过程。活细胞成像方案已被用于测量和量化细胞极性7,8,9,10,纺锤体取向11,12,13,肌动肌蛋白皮14,15,16,17,18,微管和中心体生物学

研究方案

注意: 图1 显示了进行本研究所需的材料。

1. 实验的注意事项和准备

  1. 防止幼虫过度拥挤。
    注意:外植体幼虫大脑的质量与解剖前幼虫的健康和质量直接相关。因过度拥挤而营养不良的幼虫通常会产生质量较低的大脑30
    1. 确保每个餐盖培养皿的幼虫不超过20-30只,以避免营养不良。这些示例如图 2 所示。
  2. 使用前过滤并等分施耐德培养基。
    1. 对于每次解剖,通过用1%牛生长血清(BGS)补充等分的施耐德昆虫培养基来制备新鲜的成像和解剖培养基。5 mL 的解剖和成像介质体积通常足以进行成像实验。
    2. 使用前将补充的培养基加热至室温 (RT)。
  3. 考虑要收集的短片的长度,并用它来考虑成像介质的补充、安装方法和显微镜的采集设置。
    注意:在最佳条件下,仅补充BGS的大脑中的NB将强有力地分裂3小时以上。
    1. 通过在成像介质中添加幼虫脂肪体组织来补充成像培养基,以支持在进行需要更长电影的实验时超过4小时的分裂。
      注意:脂肪体分泌支持NB增殖的有丝分裂原31,来自10个幼虫的整个脂肪....

代表性结果

中枢脑叶NBs的解剖和成像表达Pins::EGFP和樱桃::木星
为了展示这一协议,表达UAS驱动的樱桃::木星13和内源性标记的Pins::EGFP16(w; worGal4,UAS-cherry::jupiter/CyO;引脚::EGFP / TM6B,Tb)使用多孔成像载玻片使用所述方案成像4小时(图5C,D)。其他数据取自表达UAS驱动的樱桃::木星13的.......

讨论

该协议概述了一种从 黑腹果蝇 幼虫对活外植体大脑进行成像的方法。这里描述的方案允许在正确的实验条件下观察外植体大脑12-20小时。必须特别考虑样品的制备和所需实验的设计。如上所述,决定解剖组织质量的最关键因素之一是幼虫的健康。为了达到尽可能高的质量,必须确保幼虫在采集前得到良好的喂养。不健康的幼虫最常见的原因是过度拥挤。为了解决这个问题,必须确保通过增.......

披露声明

作者没有财务披露需要申报。

致谢

这项研究得到了R35GM148160(C.C.)和美国国立卫生研究院(NIH)培训补助金T32 GM007270(R.C.S)的支持。

....

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm polyethersulfone (PES) MembraneGenesee25-231Vacuum-driven filters
AgarGenesee20-248granulated agar
Analytical ComputerDellNAIntel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system
Bovine Growth SerumHyCloneSH30541.02
Chambered Imaging SlidesIbidi80826
Confocal MicroscopeNikonNA
Custom-machined metal slideNANASee Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications
Dissection DishesFisher Scientific50243433-well porcelain micro spot plate
Dissection ForcepsWorld Precision InstrumentsDumont #5
Dissection MicroscopeLeicaNA
Dissection ScissorsFine Science Tools (FST)15003-08
Embryo collection cageGenesee59-100
Flypad with access to CO2 to anesthetize adult fliesGenesee59-172
Gas-permeable membraneYSI98095Gas-permeable membrane
Glass Cover SlidesElectron Microscopy Sciences72204-03# 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips
ImarisOxford InstrumentsNAAlternatives: Fiji, Volocity, Aivia
Imaris File ConverterOxford InstrumentsNA
Instant YeastSaf-InstantNA
MolassesGenesee62-117
Petri dishGreiner Bio-One62816160 mm x 15 mm Petri dish
Petroleum JellyVaselineNA
Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquidMillipore SigmaS0146
SlideBook acquisition software3iNA
Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filterGenesee Scientific, GenClone25-231

参考文献

  1. Delgado, M. K., Cabernard, C. Mechanical regulation of cell size, fate, and behavior during asymmetric cell division. Current Opinion in Cell Biology. 67, 9-16 (2020).
  2. Sunchu, B., Cabernard, C. Principles and mec....

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