Imagerie de cellules vivantes du cerveau larvaire du troisième stade de Drosophila melanogaster

Résumé

Ici, nous discutons d’un flux de travail pour préparer, disséquer, monter et imager des cerveaux d’explants vivants de larves du troisième stade de Drosophila melanogaster afin d’observer la dynamique cellulaire et subcellulaire dans des conditions physiologiques.

Résumé

Les cellules souches neurales de la drosophile (neuroblastes, NBs ci-après) subissent des divisions asymétriques, régénérant le neuroblaste auto-renouvelant, tout en formant une cellule mère ganglionnaire différenciatrice (GMC), qui subira une division supplémentaire pour donner naissance à deux neurones ou glies. Des études sur les NB ont révélé les mécanismes moléculaires sous-jacents à la polarité cellulaire, à l’orientation du fuseau, à l’auto-renouvellement des cellules souches neurales et à la différenciation. Ces divisions cellulaires asymétriques sont facilement observables par imagerie de cellules vivantes, ce qui rend les NB larvaires idéales pour étudier la dynamique spatio-temporelle de la division cellulaire asymétrique dans les tissus vivants. Lorsqu’ils sont correctement disséqués et imagés dans un milieu enrichi en nutriments, les NB dans les cerveaux explantés se divisent vigoureusement pendant 12 à 20 heures. Les méthodes décrites précédemment sont techniquement difficiles et peuvent être difficiles pour ceux qui débutent dans le domaine. Ici, un protocole est décrit pour la préparation, la dissection, le montage et l’imagerie d’explants cérébraux larvaires vivants du troisième stade à l’aide de suppléments de corps gras. Les problèmes potentiels sont également discutés, et des exemples sont fournis sur la façon dont cette technique peut être utilisée.

Introduction

La division cellulaire asymétrique (DCA) est le processus par lequel les composants subcellulaires tels que l’ARN, les protéines et les organites sont répartis de manière inégale entre les cellules filles ^1,2. Ce processus est couramment observé dans les cellules souches, qui subissent une DCA pour donner naissance à des cellules filles avec des destins de développement différents. Drosophile Les NB se divisent de manière asymétrique pour produire un NB, qui conserve sa souche, et une cellule mère ganglionnaire (GMC). Le GMC subit d’autres divisions pour produire des neurones différenciateurs ou glies....

Protocole

REMARQUE : La figure 1 montre les matériaux requis pour réaliser cette étude.

1. Considérations et préparatifs de l’expérience

1. Empêchez les larves de surpeupler.
   REMARQUE : La qualité des cerveaux larvaires d’explantation est directement liée à la santé et à la qualité des larves avant la dissection. Les larves qui souffrent de malnutrition à cause de la surpopulation produiront généralement des cerveaux de qualité inférieure³⁰.
   1. Assurez-vous qu’il n’y a pas plus de 20 à 30 larves par plat de chapeau de repas pour éviter la malnutrition. Des exemples d....

Discussion

Ce protocole décrit une approche pour l’imagerie de cerveaux d’explants vivants provenant de larves de Drosophila melanogaster . Le protocole décrit ici permet d’observer les cerveaux d’explant pendant 12 à 20 h dans les bonnes conditions expérimentales. Une attention particulière doit être accordée à la préparation des échantillons et à la conception des expériences souhaitées. Comme mentionné ci-dessus, l’un des facteurs les plus critiques qui détermine la qualité du tissu disséqué .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane	Genesee	25-231	Vacuum-driven filters
Agar	Genesee	20-248	granulated agar
Analytical Computer	Dell	NA	Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system
Bovine Growth Serum	HyClone	SH30541.02
Chambered Imaging Slides	Ibidi	80826
Confocal Microscope	Nikon	NA
Custom-machined metal slide	NA	NA	See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications
Dissection Dishes	Fisher Scientific	5024343	3-well porcelain micro spot plate
Dissection Forceps	World Precision Instruments	Dumont #5
Dissection Microscope	Leica	NA
Dissection Scissors	Fine Science Tools (FST)	15003-08
Embryo collection cage	Genesee	59-100
Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies	Genesee	59-172
Gas-permeable membrane	YSI	98095	Gas-permeable membrane
Glass Cover Slides	Electron Microscopy Sciences	72204-03	# 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips
Imaris	Oxford Instruments	NA	Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia
Imaris File Converter	Oxford Instruments	NA
Instant Yeast	Saf-Instant	NA
Molasses	Genesee	62-117
Petri dish	Greiner Bio-One	628161	60 mm x 15 mm Petri dish
Petroleum Jelly	Vaseline	NA
Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid	Millipore Sigma	S0146
SlideBook acquisition software	3i	NA
Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter	Genesee Scientific, GenClone	25-231