ショウジョウバエメラノガスター第3齢幼虫脳の生細胞イメージング

要約

本稿では,ショウ ジョウバエ・メラノガスター 第3齢幼虫から生きた外植片脳を作製,解剖,マウント,画像化し,生理条件下での細胞内・細胞内動態を観察するワークフローについて述べる.

要約

ショウジョウバエ 神経幹細胞(神経芽細胞、以下NB)は非対称分裂を起こし、自己複製神経芽細胞を再生すると同時に、分化神経節母細胞(GMC)を形成し、さらに1つの分裂を経て2つのニューロンまたはグリアを生成します。NBの研究により、細胞の極性、紡錘体の配向、神経幹細胞の自己複製、および分化の根底にある分子メカニズムが明らかになりました。これらの非対称細胞分裂は生細胞イメージング で 容易に観察できるため、幼虫NBは生体組織における非対称細胞分裂の時空間ダイナミクスを調べるのに理想的です。栄養補給培地で適切に解剖および画像化すると、外植片の脳のNBは12〜20時間にわたって堅牢に分裂します。前述の方法は技術的に難しく、この分野に不慣れな人にとっては難しいかもしれません。ここでは、脂肪体サプリメントを使用した生きた3齢幼虫の脳外植片の調製、解剖、マウント、およびイメージングのためのプロトコルについて説明します。潜在的な問題についても説明し、この手法の使用方法の例を提供します。

概要

不斉細胞分裂(ACD)は、RNA、タンパク質、細胞小器官などの細胞内成分が娘細胞間で不均等に分配されるプロセスです^1,2。このプロセスは、ACDを受けて異なる発生運命を持つ娘細胞を生じさせる幹細胞で一般的に見られます。ショウジョウバエNBは非対称に分裂して、そのステム性を保持する1つのNBと1つの神経節母細胞(GMC)を生成します。GMCは、分化ニューロンまたはグリア³を生成するためにさらなる分裂を受ける。非対称分裂NBは、3齢幼虫の発達中の脳に豊富にあり、顕微鏡で容易に観察できます。3齢幼虫期では、各中枢脳葉3,4,5,6に約100個のNBが存在する。

非対称細胞分裂は非常に動的なプロセスです。生細胞イメージングプロトコルは、細胞極性7,8,9,10

プロトコル

注: 図1 は、この調査を実行するために必要な資料を示しています。

1. 実験の検討と準備

1. 幼虫が過密になるのを防ぎます。
   注:外植幼虫の脳の質は、解剖前の幼虫の健康と質に直接関係しています。過密から栄養失調の幼虫は、一般的に低品質の脳を生み出します³⁰。
   1. 栄養失調を避けるために、ミールキャップディッシュごとに20〜30匹以下の幼虫が存在することを確認してください。これらの例を 図 2 に示します。
2. 使用前にシュナイダー培地をろ過して分注します。
   1. 各解剖について、分注したシュナイダー昆虫培地に1%ウシ成長血清(BGS)を添加して、新鮮なイメージングおよび解剖培地を調製します。イメージング実験には、通常、5 mLの容量の解剖およびイメージング媒体で十分です。
   2. 使用前に、添加した培地を室温(RT)まで温めてください。
3. 収集するフィルムの長さを考慮し、それを使用して、イメージング媒体の補充、実装アプローチ、および顕微鏡の取得設定を考慮します。
   注:最適な条件下では、BGSのみを補給した脳のNBは、3時間以上にわたって....

ディスカッション

このプロトコルは、 ショウジョウバエメラノガスター 幼虫からの生きた外植片脳のイメージングのための1つのアプローチを概説します。ここで説明するプロトコルは、適切な実験条件下で外植片脳を12〜20時間観察することを可能にする。サンプルの調製と目的の実験の設計には特別な考慮が必要です。上記のように、解剖された組織の質を決定する最も重要な要素の1つは幼虫の健?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane	Genesee	25-231	Vacuum-driven filters
Agar	Genesee	20-248	granulated agar
Analytical Computer	Dell	NA	Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system
Bovine Growth Serum	HyClone	SH30541.02
Chambered Imaging Slides	Ibidi	80826
Confocal Microscope	Nikon	NA
Custom-machined metal slide	NA	NA	See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications
Dissection Dishes	Fisher Scientific	5024343	3-well porcelain micro spot plate
Dissection Forceps	World Precision Instruments	Dumont #5
Dissection Microscope	Leica	NA
Dissection Scissors	Fine Science Tools (FST)	15003-08
Embryo collection cage	Genesee	59-100
Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies	Genesee	59-172
Gas-permeable membrane	YSI	98095	Gas-permeable membrane
Glass Cover Slides	Electron Microscopy Sciences	72204-03	# 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips
Imaris	Oxford Instruments	NA	Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia
Imaris File Converter	Oxford Instruments	NA
Instant Yeast	Saf-Instant	NA
Molasses	Genesee	62-117
Petri dish	Greiner Bio-One	628161	60 mm x 15 mm Petri dish
Petroleum Jelly	Vaseline	NA
Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid	Millipore Sigma	S0146
SlideBook acquisition software	3i	NA
Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter	Genesee Scientific, GenClone	25-231