Lebendzell-Bildgebung von Drosophila melanogaster im dritten Stadium des Larvengehirns

Zusammenfassung

Hier diskutieren wir einen Arbeitsablauf zur Präparation, Sektion, Montage und Bildgebung von lebenden Explantatgehirnen aus Drosophila melanogaster-Larven des dritten Stadiums, um die zelluläre und subzelluläre Dynamik unter physiologischen Bedingungen zu beobachten.

Zusammenfassung

Drosophila-neurale Stammzellen (Neuroblasten, im Folgenden NBs) durchlaufen asymmetrische Teilungen, die den sich selbst erneuernden Neuroblasten regenerieren und gleichzeitig eine differenzierende Ganglienmutterzelle (GMC) bilden, die eine zusätzliche Teilung durchläuft, um zwei Neuronen oder Gliazellen entstehen zu lassen. Studien an NBs haben die molekularen Mechanismen aufgedeckt, die der Zellpolarität, der Spindelorientierung, der Selbsterneuerung neuraler Stammzellen und der Differenzierung zugrunde liegen. Diese asymmetrischen Zellteilungen sind durch Lebendzell-Bildgebung leicht zu beobachten, wodurch sich Larven-NBs ideal für die Untersuchung der räumlich-zeitlichen Dynamik der asymmetrischen Zellteilung in lebendem Gewebe eignen. Bei richtiger Präparation und Abbildung in nährstoffangereichertem Medium teilen sich NBs im Explantatgehirn 12-20 Stunden lang robust. Die zuvor beschriebenen Methoden sind technisch schwierig und können für Neulinge auf diesem Gebiet eine Herausforderung darstellen. Hier wird ein Protokoll für die Präparation, Präparation, Montage und Bildgebung von lebenden Larvenexplantaten des dritten Stadiums unter Verwendung von Fettkörperpräparaten beschrieben. Es werden auch mögliche Probleme diskutiert und Beispiele für den Einsatz dieser Technik gegeben.

Einleitung

Asymmetrische Zellteilung (ACD) ist der Prozess, bei dem subzelluläre Komponenten wie RNA, Proteine und Organellen ungleichmäßig auf die Tochterzellen verteilt werden ^1,2. Dieser Prozess ist häufig bei Stammzellen zu beobachten, die ACD durchlaufen, um Tochterzellen mit unterschiedlichen Entwicklungsschicksalen hervorzubringen. Drosophila NBs teilen sich asymmetrisch und erzeugen eine NB, die ihre Stammform beibehält, und eine Ganglienmutterzelle (GMC). Das GMC durchläuft weitere Teilungen, um differenzierende Neuronen oder Gliazellen^{zu erzeugen 3}. Asymmetrisch teilende NBs sin....

Protokoll

HINWEIS: Abbildung 1 zeigt die Materialien, die für die Durchführung dieser Studie erforderlich sind.

1. Überlegungen und Vorbereitungen für das Experiment

1. Verhindern Sie, dass sich die Larven überfüllen.
   HINWEIS: Die Qualität der Larvengehirne steht in direktem Zusammenhang mit der Gesundheit und Qualität der Larven vor der Sektion. Larven, die durch Überfüllung unterernährt sind, bringen im Allgemeinen Gehirne von geringerer Qualität^{hervor 30}.
   1. Stellen Sie sicher, dass nicht mehr als 20-30 Larven pro Mahlzeit vorhanden sind, um eine Mangelernährung z....

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz für die Bildgebung von lebenden Explantatgehirnen aus Drosophila melanogaster-Larven . Das hier beschriebene Protokoll erlaubt es, Explantatgehirne für 12-20 Stunden unter den richtigen experimentellen Bedingungen zu beobachten. Besonderes Augenmerk muss auf die Vorbereitung der Proben und das Design der gewünschten Experimente gelegt werden. Wie bereits erwähnt, ist einer der kritischsten Faktoren, der die Qualität des präparierten Gewebes bestimmt, die Gesundheit .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane	Genesee	25-231	Vacuum-driven filters
Agar	Genesee	20-248	granulated agar
Analytical Computer	Dell	NA	Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system
Bovine Growth Serum	HyClone	SH30541.02
Chambered Imaging Slides	Ibidi	80826
Confocal Microscope	Nikon	NA
Custom-machined metal slide	NA	NA	See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications
Dissection Dishes	Fisher Scientific	5024343	3-well porcelain micro spot plate
Dissection Forceps	World Precision Instruments	Dumont #5
Dissection Microscope	Leica	NA
Dissection Scissors	Fine Science Tools (FST)	15003-08
Embryo collection cage	Genesee	59-100
Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies	Genesee	59-172
Gas-permeable membrane	YSI	98095	Gas-permeable membrane
Glass Cover Slides	Electron Microscopy Sciences	72204-03	# 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips
Imaris	Oxford Instruments	NA	Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia
Imaris File Converter	Oxford Instruments	NA
Instant Yeast	Saf-Instant	NA
Molasses	Genesee	62-117
Petri dish	Greiner Bio-One	628161	60 mm x 15 mm Petri dish
Petroleum Jelly	Vaseline	NA
Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid	Millipore Sigma	S0146
SlideBook acquisition software	3i	NA
Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter	Genesee Scientific, GenClone	25-231