Imágenes de células vivas de cerebros larvales del tercer estadio de Drosophila melanogaster

Resumen

Aquí, discutimos un flujo de trabajo para preparar, diseccionar, montar y obtener imágenes de cerebros de explante vivos de larvas del tercer estadio de Drosophila melanogaster para observar la dinámica celular y subcelular en condiciones fisiológicas.

Resumen

Las células madre neurales de Drosophila (neuroblastos, NB en adelante) experimentan divisiones asimétricas, regenerando el neuroblasto autorrenovador, al tiempo que forman una célula madre ganglionar diferenciadora (GMC), que sufrirá una división adicional para dar lugar a dos neuronas o glía. Los estudios en NB han descubierto los mecanismos moleculares subyacentes a la polaridad celular, la orientación del huso, la autorrenovación de las células madre neurales y la diferenciación. Estas divisiones celulares asimétricas son fácilmente observables a través de imágenes de células vivas, lo que hace que las larvas sean ideales para investigar la dinámica espaciotemporal de la división celular asimétrica en el tejido vivo. Cuando se diseccionan adecuadamente y se obtienen imágenes en un medio suplementado con nutrientes, los NB en los cerebros de explante se dividen robustamente durante 12-20 h. Los métodos descritos anteriormente son técnicamente difíciles y pueden ser desafiantes para aquellos nuevos en el campo. Aquí, se describe un protocolo para la preparación, disección, montaje e imágenes de explantes cerebrales larvales vivos del tercer estadio utilizando suplementos corporales gordos. También se discuten los problemas potenciales y se proporcionan ejemplos de cómo se puede utilizar esta técnica.

Introducción

La división celular asimétrica (ACD) es el proceso por el cual los componentes subcelulares como el ARN, las proteínas y los orgánulos se dividen de manera desigual entre las células hijas ^1,2. Este proceso se ve comúnmente en las células madre, que se someten a ACD para dar lugar a células hijas con diferentes destinos de desarrollo. Drosophila Los NB se dividen asimétricamente para producir un NB, que conserva su tallo, y una célula madre ganglionar (GMC). El GMC sufre más divisiones para producir neuronas diferenciadoras o glía³. Los NB que se dividen asimétricamente son abundantes en los cerebros en desarrollo de las larvas del tercer estadio, que se observan fácilmente a través de la microscopía. En la tercera etapa larvaria del estadio, hay aproximadamente 100 NB presentes en cada lóbulo cerebral central 3,4,5,6.

La división celular asimétrica es un proceso altamente dinámico. Se han utilizado protocolos de imagen de células vivas para medir y cuantificar la dinámica de la polaridad celular 7,8,9,10, la orientación del huso 11,12,13, la dinámica de la corteza de actomiosina 14,15,16,17,18, la biología de microtúbulos y centrosomas ^19,20,21,22,23,24,25,26,27, y membrana ^10,28 y dinámica de la cromatina ²⁹. Las descripciones cualitativas y cuantitativas de ACD se basan en métodos y protocolos robustos para dividir imágenes NB en cerebros vivos intactos. El siguiente protocolo describe métodos para preparar, diseccionar y obtener imágenes de cerebros larvales del tercer estadio para obtener imágenes de células vivas in vivo utilizando dos enfoques de montaje diferentes. Estos métodos son más adecuados para investigadores interesados en la dinámica espaciotemporal de las divisiones de células madre, así como las divisiones en otras células cerebrales, ya que permiten observaciones a corto y largo plazo de eventos celulares. Además, estas técnicas son fácilmente accesibles para los recién llegados al campo. Demostramos la efectividad y adaptabilidad de este enfoque con cerebros larvales que expresan microtúbulos marcados fluorescentemente y proteínas de fusión cortical. Además, discutimos los métodos de análisis y las consideraciones para su aplicación en otros estudios.

Protocolo

NOTA: La figura 1 muestra los materiales necesarios para realizar este estudio.

1. Consideraciones y preparativos para el experimento

1. Evite que las larvas se hacinen.
   NOTA: La calidad de los cerebros larvales explante está directamente relacionada con la salud y la calidad de las larvas antes de la disección. Las larvas que están desnutridas por el hacinamiento generalmente producirán cerebros de menor calidad³⁰.
   1. Asegúrese de que no haya más de 20-30 larvas presentes por plato de tapa de comida para evitar la desnutrición. Ejemplos de estos se pueden ver en la Figura 2.
2. Filtrar y alícuota el medio de Schneider antes de usarlo.
   1. Para cada disección, prepare nuevas imágenes y medio de disección complementando el medio de insectos de Schneider con suero de crecimiento bovino (BGS) al 1%. Un volumen de 5 ml de disección y medio de imagen suele ser suficiente para un experimento de imagen.
   2. Caliente el medio suplementado a temperatura ambiente (RT) antes de usarlo.
3. Considere la duración de la película que se recopilará y utilícela para factorizar la suplementación del medio de imagen, el enfoque de montaje y los ajustes de adquisición del microscopio.
   NOTA: En condiciones óptimas, los NB en cerebros suplementados solo con BGS se dividirán robustamente durante más de 3 h.
   1. Complemente el medio de imagen agregando tejidos corporales grasos larvales al medio de imagen para soportar divisiones pasadas 4 h cuando realice experimentos que requieran películas más largas.
      NOTA: Los cuerpos grasos secretan mitógenos que apoyan la proliferación de NB³¹, y los cuerpos enteros de grasa de 10 larvas son suficientes para soportar de cuatro a cinco cerebros. Además, se ha demostrado que las muestras fotografiadas con un portaobjetos unido a la membrana se dividen durante más de 10 h^13,32, mientras que las muestras fotografiadas con un portaobjetos de múltiples pocillos generalmente se dividen con menos frecuencia (observaciones no publicadas).
   2. Alternativamente, implemente un medio de imagen más complejo para películas más largas, como se describió anteriormente³³. Minimice el fotodaño ajustando el tiempo de exposición, la potencia del láser y la frecuencia de muestreo para obtener mejores resultados.

2. Estadificación y recolección de larvas (Figura 2)

1. Cruce moscas vírgenes hembras de 1-5 días de edad con moscas macho adultas de 1-7 días de edad para producir progenie con el genotipo deseado. Para un rendimiento óptimo, cruce 10-15 vírgenes hembras con 5-10 machos. Depositar estas moscas en una jaula para moscas con un gorro de comida (Figura 2A-C) e incubar a 25 °C.
2. Cambie la tapa de comida diariamente. Esto evita que las tapas de comida se llenen de larvas, lo que reduce la calidad de los cerebros disecados.
3. Si la tapa de comida está cubierta significativamente de larvas (es decir, >30), divida esta tapa de comida por la mitad y reemplace una mitad con una tapa de comida nueva que también se haya cortado por la mitad. Alternativamente, cambie las tapas de comida con mayor frecuencia (es decir, cada 12 h en lugar de cada 24 h). Se pueden ver ejemplos de tapas de comida superpobladas en la Figura 2E, F.
4. Incubar el tapón de comida con larvas a 25 °C hasta que las larvas alcancen la edad deseada.

3. Disección del cuerpo graso larval (Figura 3)

NOTA: Este protocolo describe las disecciones utilizando una placa de disección de 3 pocillos.

1. Pipetear ~400 μL de disección y medio de imagen en cada pocillo de una placa de disección de 3 pocillos.
2. Lave diez larvas de tipo silvestre de 72-96 h de edad bien alimentadas sosteniéndolas suavemente con pinzas de disección y sumergiéndolas dentro y fuera de la solución de disección en el pozo inferior hasta que se hayan lavado todas las partículas de alimentos. Después de enjuagar, mueva las larvas limpias al pozo medio.
3. Usando un juego de pinzas, sostenga la larva por los ganchos bucales. Con el otro juego de pinzas, rompe un lado de la cutícula de la larva.
4. Esta ruptura hará que los cuerpos gordos se derramen fuera de la larva. Los cuerpos grasos son blanquecinos y semitranslúcidos y tendrán una estructura en forma de celosía (Figura 3I). Los cuerpos gordos también tenderán a adherirse a sí mismos y a las pinzas de disección. Una vez identificado, recolecte la mayor cantidad posible de cuerpo graso de cada larva y transfiéralo con los fórceps al pozo superior con 400 μL de medio de disección RT.

4. Disección larvaria del cerebro (Figura 3)

1. Lave las larvas experimentales en disección y medio de imagen como el anterior para liberarlas de residuos de alimentos. Para obtener los mejores resultados, evite almacenar larvas no disecadas en la solución de disección. Esto hará que las larvas se "ahoguen" y tendrá un impacto negativo en la calidad de los cerebros disecados.
2. Usando un juego de pinzas, sostenga la larva por los ganchos bucales. Usando otro juego de pinzas, corta/arranca suavemente aproximadamente 1/3 de la larva del lado posterior (Figura 3A). Esto hará que elementos del tracto digestivo, cuerpos grasos, tejido conectivo y sistema nervioso "estallen" del lado roto de la larva (Figura 3B).
3. Usando un juego de pinzas, sostenga la larva por los ganchos bucales. Con el otro juego de pinzas, cepille suavemente la cutícula hacia los ganchos bucales mientras "empuja" hacia adentro con las pinzas que sostienen los ganchos bucales hasta que toda la larva esté al revés. Este movimiento es similar a girar un calcetín "de adentro hacia afuera" (Figura 3C, D).
4. Invierta la larva para que el sistema nervioso central y otros tejidos miren hacia afuera mientras aún están conectados a la cutícula. En este paso, localice el sistema nervioso central (SNC) para evitar la extirpación accidental. Usando pinzas, retire suavemente todo el tejido que no sea del SNC, dejando solo el SNC y el cerebro unidos a la cutícula (Figura 3E).
5. El cerebro se unirá a la cutícula a través de conexiones axonales. Usando tijeras de microdisección, corte estas conexiones axonales para liberar el cerebro de la cutícula. Para hacer esto, primero corte suavemente debajo de los lóbulos cerebrales (Figura 3F). Repita con las conexiones debajo del cordón nervioso ventral.
   NOTA: Este paso se puede hacer con pinzas si las tijeras de microdisección no están disponibles. Tenga especial cuidado al usar pinzas para asegurarse de que el tejido cerebral no se estire demasiado durante la extracción de la cutícula porque el estrés mecánico afectará negativamente la salud del cerebro.
6. Transfiera el cerebro diseccionado a un pozo con disección y medio de imagen. Para experimentos de imágenes de más de 3 h, use disección y medio de imagen suplementado con cuerpos grasos como se describió anteriormente. Diseccionar las larvas en lotes para mantener el tiempo de disección por debajo de 20 min.

5. Montaje e imágenes (Figura 4)

1. Para obtener imágenes con una diapositiva³⁴ unida a la membrana:
   1. Recolecte cerebros disecados y cuerpos grasos aislados en el último pocillo de la placa de disección.
   2. Ensamble la mitad del portaobjetos colocando una membrana permeable al gas sobre la parte posterior del portaobjetos y presione el anillo dividido en el centro, manteniéndolo en su lugar (Figura 4A-C).
   3. Usando una micropipeta de 200 μL, transfiera hasta 10 cerebros disecados y la mayor cantidad posible de cuerpo graso (ver arriba) en ~130-140 μL de disección y medio de imagen a la membrana. Asegúrese de depositar el medio con las muestras en el centro de la membrana permeable al gas (Figura 4D, E).
   4. Orientar los cerebros para la población de RNs a ser fotografiada y para el tipo de microscopio que se utiliza (Figura 4E). Coloque la muestra lo más cerca posible del objetivo del microscopio. Por ejemplo, para obtener imágenes de NB en los lóbulos centrales del cerebro, oriente los cerebros de tal manera que los lóbulos cerebrales estén más cerca del objetivo (Figura 4H).
   5. Una vez que los cerebros estén orientados, coloque suavemente un cubreobjetos de vidrio sobre la solución en la membrana. Esto hará que la solución que contiene los cerebros y los cuerpos grasos se extienda sobre la totalidad de la membrana (Figura 4F).
   6. Seque la solución excesiva sosteniendo un tejido de laboratorio cerca del borde del cubreobjetos. La cantidad óptima de solución se logra cuando los cerebros tocan el cubreobjetos sin ser aplastados. Si se requiere reorientación en este paso, mueva con cuidado el cubreobjetos para mover los cerebros.
   7. Inmovilice el cubreobjetos aplicando vaselina derretida a lo largo de los bordes del cubreobjetos con un pincel. Permita que la gelatina se solidifique (Figura 4G).
2. Para obtener imágenes con una diapositiva de imágenes de múltiples pocillos (Figura 4):
   1. Agregue 400 μL de medio de imagen a un pocillo de un portaobjetos de múltiples pocillos (en el experimento realizado aquí, se utilizó un micro[μ] portaobjetos de 8 pocillos con cámara; Figura 4I). Transfiera los cuerpos grasos previamente diseccionados a este pocillo (ver paso 3.4).
   2. Depositar hasta 10 cerebros en un grupo cerca del centro del pozo (Figura 4J).
   3. Orientar los cerebros para la población de RN que se va a obtener imágenes y para el tipo de microscopio que se utiliza, como se describe en el paso 5.1.4 (Figura 4K). Organice las muestras de manera que estén cerca una de la otra. Esto minimizará la distancia que la etapa debe moverse entre las muestras, lo que reduce la deriva de la muestra durante la adquisición.
   4. Una vez que los cerebros se hayan orientado en el pozo, permita que los cerebros se asienten durante 2-5 minutos. Esto aumenta su estabilidad durante el transporte / imagen. Prepare el microscopio para la adquisición durante este tiempo.
   5. Cubra el portaobjetos μ con la cubierta del portaobjetos y transfiéralo al microscopio. Comience la adquisición con la menor potencia láser y tiempo de exposición posible para minimizar el fotoblanqueo.

6. Mejores prácticas de procesamiento y gestión de datos

1. Procese los datos según sea necesario de acuerdo con el software de análisis disponible.
   1. Para el ejemplo que se muestra aquí, guarde los datos adquiridos con el software SlideBook como un archivo de imagen de SlideBook (.sld).
   2. Para convertir al tipo de archivo propietario de Imaris (.ims) utilizando el convertidor de archivos de Imaris, abra el convertidor de archivos de Imaris en una ventana separada. Haga clic y arrastre los archivos .sld a la sección "entrada" del convertidor de archivos Imaris.
   3. Determine la ubicación de salida deseada para los archivos convertidos y haga clic en "Iniciar todo".
   4. Después de la conversión, vea y anote los datos en el software Imaris.
      NOTA: Se pueden usar alternativas para el análisis de imágenes en lugar de Imaris, como Fiji (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html), Aivia (https://www.aivia-software.com/), Volocity (https://www.volocity4d.com/) u otros.
2. Conserve la mayor cantidad posible de datos originales para el mantenimiento adecuado de registros. Por ejemplo, si el software de adquisición se guarda en un formato de archivo pero se convierte a un formato diferente para su análisis, conserve la versión adquirida de los datos.
3. Para el análisis de datos, mantenga un registro de tantos detalles como sea posible sobre la muestra y la configuración de adquisición. La información clave para retener incluye el genotipo de las larvas disecadas, la edad de las larvas antes de la disección, el estado de la tapa de comida en la que fueron criadas, la potencia del láser utilizada durante la obtención de imágenes, el tiempo de exposición, la duración de la adquisición y la resolución temporal.

7. Ejemplo de cuantificación de la duración del ciclo celular (Figura 5)

NOTA: en este ejemplo, se obtuvieron imágenes de larvas que expresan el marcador de polaridad Pins (Pins::EGFP¹⁶) y la proteína de unión a microtúbulos Júpiter²⁵ (cereza::Júpiter¹³). El análisis posterior se realizó utilizando el software Imaris.

1. Abra la película utilizando el software de análisis de imágenes de su elección. Desplácese por la longitud de la película para identificar los NB divididos y etiquételos para referencia futura. Identifique los RN divisorios por sus distintos husos mitóticos (Figura 5C-E).
2. Identifique una etapa del ciclo celular de referencia para determinar la duración del ciclo celular. En este ejemplo, metaphase se utiliza como referencia.
3. Determine manualmente el número de fotogramas entre metafases sucesivas y conviértalo en minutos u horas para determinar el tiempo necesario para completar un ciclo celular.
   1. Haga esto tomando la resolución temporal de la película y multiplicándola por el número de fotogramas entre metafases. Por ejemplo, si la resolución temporal de la película es de un fotograma cada 5 minutos, y las metafases se observan en el fotograma 13 y el fotograma 35, el tiempo entre estas metafases sería de 110 min ([35 − 13] × 5).
4. Trazar los datos con cualquier software apropiado. Los datos que se muestran aquí se trazaron utilizando el software PRISM.

8. Ejemplo de cuantificación de la alineación del huso celular (Figura 5)

NOTA: En este ejemplo, el análisis se realiza utilizando el software Imaris.

1. Abra el archivo de película en Imaris u otro software de su elección. Desplácese por la longitud de la película para identificar los NB divididos y etiquételos para referencia futura.
2. Determine el vector formado por los polos del huso utilizando los centrosomas apical y basal (representados por m), de la siguiente manera:
   
   donde Ax, Ay, y Az son las coordenadas del centrosoma apical, y Bx, By y Bz son las coordenadas del centrosoma basal. Del mismo modo, el eje del vector de división (representado por n) está formado por el punto medio de los pines apicales::EGFP media luna y la corteza basal:
   
   donde Ax, Ay, y Az son las coordenadas del punto medio de los Pines::EGFP media luna, y Bx, By, y Bz son las coordenadas del punto medio de la corteza basal.
3. Determina la magnitud de los vectores m y n:
   Magnitud de m:
   Magnitud de n:
4. Determine el producto punto (representado por k) de m y n:
   
5. Usando el producto de puntos k y las magnitudes vectoriales m y n, determina el ángulo entre los vectores:
   
6. Trazar los datos en el software de su elección. Los datos que se muestran aquí fueron preparados en Microsoft Excel y visualizados en PRISM.

Resultados

Disección e imágenes del lóbulo central del cerebro NBs que expresan Pins::EGFP y Cherry::Júpiter
Para mostrar este protocolo, las larvas que expresan Cherry::Jupiter¹³ y Pins endógenamente etiquetados::EGFP¹⁶ (w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; Pins::EGFP/TM6B, Tb) se obtuvieron imágenes durante 4 h utilizando el protocolo descrito utilizando diapositivas de imágenes de múltiples pocillos (Figura 5C, D

Discusión

Este protocolo describe un enfoque para la obtención de imágenes de cerebros de explante vivos de larvas de Drosophila melanogaster . El protocolo descrito aquí permite observar cerebros de explante durante 12-20 h en las condiciones experimentales adecuadas. Se debe prestar especial atención a la preparación de muestras y al diseño de los experimentos deseados. Como se mencionó anteriormente, uno de los factores más críticos que determina la calidad del tejido disecado es la salud de las larvas. Para l...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane	Genesee	25-231	Vacuum-driven filters
Agar	Genesee	20-248	granulated agar
Analytical Computer	Dell	NA	Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system
Bovine Growth Serum	HyClone	SH30541.02
Chambered Imaging Slides	Ibidi	80826
Confocal Microscope	Nikon	NA
Custom-machined metal slide	NA	NA	See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications
Dissection Dishes	Fisher Scientific	5024343	3-well porcelain micro spot plate
Dissection Forceps	World Precision Instruments	Dumont #5
Dissection Microscope	Leica	NA
Dissection Scissors	Fine Science Tools (FST)	15003-08
Embryo collection cage	Genesee	59-100
Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies	Genesee	59-172
Gas-permeable membrane	YSI	98095	Gas-permeable membrane
Glass Cover Slides	Electron Microscopy Sciences	72204-03	# 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips
Imaris	Oxford Instruments	NA	Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia
Imaris File Converter	Oxford Instruments	NA
Instant Yeast	Saf-Instant	NA
Molasses	Genesee	62-117
Petri dish	Greiner Bio-One	628161	60 mm x 15 mm Petri dish
Petroleum Jelly	Vaseline	NA
Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid	Millipore Sigma	S0146
SlideBook acquisition software	3i	NA
Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter	Genesee Scientific, GenClone	25-231