הדמיה של תאים חיים של Drosophila melanogaster מוח זחל כוכב שלישי

Summary

כאן, אנו דנים בתהליך עבודה להכנה, ניתוח, הרכבה ותמונה של מוחות צמחים חיים מזחלי Drosophila melanogaster Third instar כדי לצפות בדינמיקה התאית והתת-תאית בתנאים פיזיולוגיים.

Abstract

תאי גזע עצביים דרוזופילה (נוירובלסטים, NBs להלן) עוברים חלוקות אסימטריות, מחדשות את הנוירובלסט המתחדש מעצמו, תוך יצירת תא אם גנגליון מתמיין (GMC), שיעבור חלוקה אחת נוספת כדי ליצור שני נוירונים או גליה. מחקרים ב- NBs חשפו את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס קוטביות התא, כיוון הציר, התחדשות עצמית של תאי גזע עצביים והתמיינות. חלוקות תאים אסימטריות אלה ניתנות לצפייה בקלות באמצעות הדמיה של תאים חיים, מה שהופך את NBs הזחלים למתאימים באופן אידיאלי לחקר הדינמיקה המרחבית-זמנית של חלוקת תאים אסימטרית ברקמה חיה. כאשר מנתחים אותם כראוי ומדמיינים אותם במדיום עם תוספי תזונה, NBs במוחות explant מתחלקים בצורה חזקה במשך 12-20 שעות. שיטות שתוארו קודם לכן הן קשות מבחינה טכנית ועשויות להיות מאתגרות לאלה החדשים בתחום. כאן, מתואר פרוטוקול להכנה, נתיחה, הרכבה והדמיה של צמחי מוח חיים של זחל שלישי באמצעות תוספי גוף שמנים. בעיות פוטנציאליות נדונות גם, ודוגמאות מסופקות כיצד טכניקה זו ניתן להשתמש.

Introduction

חלוקת תאים אסימטרית (ACD) היא התהליך שבו רכיבים תת-תאיים כגון רנ"א, חלבונים ואברונים מחולקים באופן לא שווה בין תאי בת ^1,2. תהליך זה נפוץ בתאי גזע, אשר עוברים ACD כדי ליצור תאי בת עם גורלות התפתחותיים שונים. דרוזופילה NBs מתחלקים באופן א-סימטרי כדי לייצר NB אחד, ששומר על הגבעול שלו, ותא אם גנגליון אחד (GMC). GMC עובר חלוקות נוספות כדי לייצר נוירונים מתמיינים או גליה³. NBs המתחלקים באופן א-סימטרי נמצאים בשפע במוחות המתפתחים של זחלי כוכב שלישי, אשר נצפים בקלות באמצעות מיקרוסקופיה. בשלב הזחל השלישי של הכוכב, ישנם בערך 100 NBs נוכחים בכל אונת מוח מרכזית 3,4,5,6.

חלוקת תאים אסימטרית היא תהליך דינמי ביותר. פרוטוקולי הדמיה של תאים חיים שימשו למדידה וכימות של הדינמיקה של קוטביות התא 7,8,9,10, כיוון ציר ^11,12,13, הדינמיקה של קליפת המוח אקטומיוזין^{14,15,16,17,18}, מיקרוטובול וביולוגיה צנטרוזומית ^19,20,21,22,23,24,25,26,27, וממברנה ^10,28 ודינמיקה של כרומטין ²⁹. תיאורים איכותיים וכמותיים של ACD מסתמכים על שיטות ופרוטוקולים חזקים כדי לדמיין חלוקת NBs במוחות חיים שלמים. הפרוטוקול הבא מתאר שיטות להכנה, ניתוח ותמונה של מוחות זחלי כוכב שלישי להדמיית תאים חיים in vivo באמצעות שתי גישות הרכבה שונות. שיטות אלה מתאימות ביותר לחוקרים המתעניינים בדינמיקה מרחבית-זמנית של חלוקות תאי גזע, כמו גם חלוקות בתאי מוח אחרים, שכן הן מאפשרות תצפיות קצרות וארוכות טווח של אירועים תאיים. בנוסף, טכניקות אלה נגישות בקלות למצטרפים חדשים לתחום. אנו מדגימים את היעילות ויכולת ההסתגלות של גישה זו עם מוחות זחלים המבטאים מיקרוטובולים מתויגים פלואורסצנטית וחלבוני היתוך קליפת המוח. כמו כן נדון בשיטות ניתוח ובשיקולים ליישום במחקרים אחרים.

Protocol

הערה: איור 1 מציג את החומרים הדרושים לביצוע מחקר זה.

1. שיקולים והכנות לניסוי

1. למנוע צפיפות יתר של הזחלים.
   הערה: איכות מוחות הזחלים קשורה ישירות לבריאות ואיכות הזחלים לפני הנתיחה. זחלים הסובלים מתת-תזונה כתוצאה מצפיפות יתר יניבו בדרך כלל מוחות באיכות נמוכה יותר³⁰.
   1. ודא כי לא יותר מ 20-30 זחלים נמצאים בכל צלחת כובע ארוחה כדי למנוע תת תזונה. דוגמאות לכך ניתן לראות באיור 2.
2. סנן והעלה את המדיום של שניידר לפני השימוש.
   1. עבור כל דיסקציה, הכינו מדיום הדמיה ודיסקציה טרי על ידי תוספת מדיום החרקים של שניידר עם 1% סרום גידול בקר (BGS). נפח של 5 מ"ל של דיסקציה ואמצעי הדמיה מספיק בדרך כלל לניסוי הדמיה.
   2. יש לחמם את התוסף לטמפרטורת החדר (RT) לפני השימוש.
3. קחו בחשבון את אורך הסרט שיש לאסוף, והשתמשו בו כדי לשקלל את התוספת של מדיום ההדמיה, את גישת ההרכבה ואת הגדרות הרכישה של המיקרוסקופ.
   הערה: בתנאים אופטימליים, NBs במוחות בתוספת BGS בלבד יתחלקו בצורה חזקה כלפי מעלה של 3 שעות.
   1. השלם את מדיום ההדמיה על ידי הוספת רקמות גוף שומן הזחל למדיום ההדמיה כדי לתמוך בחלוקות מעבר ל -4 שעות בעת ביצוע ניסויים הדורשים סרטים ארוכים יותר.
      הערה: גופי שומן מפרישים מיטוגנים התומכים בהתפשטות NB³¹, וגופי שומן מלאים מ-10 זחלים מספיקים כדי לתמוך בארבעה עד חמישה מוחות. יתר על כן, דגימות שצולמו עם שקופית קשורה לקרום הוכחו מתחלקות במשך יותר מ-10 שעות^13,32, בעוד שדגימות שצולמו עם שקופית מרובת בארות בדרך כלל מתחלקות בתדירות נמוכה יותר (תצפיות שלא פורסמו).
   2. לחלופין, הטמיעו אמצעי הדמיה מורכב יותר עבור סרטים ארוכים יותר, כפי שתואר קודם לכן³³. צמצם את נזקי האור על-ידי התאמת זמן החשיפה, עוצמת הלייזר ותדירות הדגימה לקבלת התוצאות הטובות ביותר.

2. היערכות ואיסוף הזחלים (איור 2)

1. לחצות זבובים בתולים נקבה בת 1-5 ימים עם זבובים זכרים בוגרים בני 1-7 ימים כדי לייצר צאצאים עם הגנוטיפ הרצוי. לקבלת יבול אופטימלי, לחצות 10-15 בתולות נקבות עם 5-10 זכרים. הכניסו את הזבובים האלה לכלוב זבובים עם פקק ארוחה (איור 2A-C), ודגרו בטמפרטורה של 25°C.
2. החליפו את פקק הארוחה מדי יום. זה מונע מכובעי הארוחה להיות צפופים בזחלים, מה שמפחית את איכות המוח המנותח.
3. אם מכסה הארוחה מכוסה משמעותית בזחלים (כלומר >30), פצלו את פקק הארוחה לשניים, והחליפו חצי בפקק ארוחה טרי שגם הוא נחתך לשניים. לחלופין, החליפו את מכסות הארוחה על בסיס תכוף יותר (כלומר, כל 12 שעות במקום כל 24 שעות). דוגמאות למכסות ארוחה מאוכלסות יתר על המידה ניתן לראות באיור 2E, F.
4. דוגרים על פקק הארוחה עם הזחלים ב 25 מעלות צלזיוס עד שהזחלים מגיעים לגיל הרצוי.

3. דיסקציה של גוף שומן הזחל (איור 3)

הערה: פרוטוקול זה מתאר נתיחות באמצעות צלחת דיסקציה של 3 בארות.

1. פיפטה ~ 400 μL של אמצעי דיסקציה והדמיה לכל באר של צלחת דיסקציה 3 בארות.
2. שטפו עשרה זחלי בר בני 72-96 שעות הניזונים היטב על ידי החזקתם בעדינות במלקחיים לדיסקציה וטבילתם בתמיסת דיסקציה וממנה בתחתית הבאר עד שכל חלקיקי המזון נשטפו. לאחר השטיפה, מעבירים את הזחלים הנקיים לבאר האמצעית.
3. בעזרת סט אחד של פינצטה, החזיקו את הזחל ליד ווי הפה. עם קבוצה אחרת של פינצטה, לקרוע צד אחד של הקוטיקולה של הזחל.
4. קרע זה יגרום לגופי השומן להישפך החוצה מהזחל. גופי השומן הם בצבע אוף-ווייט ושקופים למחצה, ויהיה להם מבנה דמוי סריג (איור 3I). גם הגופים השמנים נוטים להיצמד לעצמם ולפינצטה הדיסקציה. לאחר הזיהוי, אספו כמה שיותר שומן מכל זחל, והעבירו אותו עם המלקחיים לבאר העליונה ביותר עם 400 מיקרוליטר של מדיום דיסקציה RT.

4. דיסקציה מוחית של הזחל (איור 3)

1. שטפו את זחלי הניסוי בדיסקציה ובאמצעי הדמיה כנ"ל כדי לשחרר אותם משאריות מזון. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, הימנעו מאחסון זחלים לא מנותחים בתמיסת הדיסקציה. זה יגרום לזחלים "לטבוע" וישפיע לרעה על איכות המוח המנותח.
2. בעזרת סט אחד של פינצטה, החזיקו את הזחל ליד ווי הפה. בעזרת קבוצה אחרת של פינצטה, חתכו/תלשו בעדינות כ-1/3 מהזחל מהצד האחורי (איור 3A). זה יגרום לאלמנטים של מערכת העיכול, גופי השומן, רקמת החיבור ומערכת העצבים "להתפוצץ" החוצה מהצד הקרוע של הזחל (איור 3B).
3. בעזרת סט אחד של פינצטה, החזיקו את הזחל ליד ווי הפה. בעזרת הפינצטה השנייה, מברישים בעדינות את הקוטיקולה לכיוון ווי הפה תוך כדי "דחיפה" פנימה כשהפינצטה מחזיקה את ווי הפה עד שכל הזחל הופך מבפנים החוצה. התנועה הזו דומה להפיכת גרב "מבפנים החוצה" (איור 3C, D).
4. הפוך את הזחל כך שמערכת העצבים המרכזית ורקמות אחרות פונות החוצה ועדיין מחוברות לקוטיקולה. בשלב זה, אתר את מערכת העצבים המרכזית (CNS) כדי למנוע הסרה בשוגג. באמצעות פינצטה, הסירו בעדינות את כל הרקמה שאינה CNS, והשאירו רק את מערכת העצבים המרכזית ואת המוח מחוברים לקוטיקולה (איור 3E).
5. המוח יהיה מחובר לקוטיקולה באמצעות חיבורים אקסונליים. באמצעות מספריים microdissection, לחתוך את הקשרים axonal האלה כדי לשחרר את המוח מן הקוטיקולה. כדי לעשות זאת, תחילה חתכו בעדינות מתחת לאונות המוח (איור 3F). חזור על הפעולה עם החיבורים מתחת לחוט העצבים הגחוני.
   הערה: שלב זה עשוי להיעשות עם פינצטה אם מספריים microdissection אינם זמינים. היזהר במיוחד בעת שימוש בפינצטה כדי להבטיח שרקמת המוח לא תימתח יתר על המידה במהלך ההסרה מהציפורן מכיוון שלחץ מכני ישפיע לרעה על בריאות המוח.
6. מעבירים את המוח המנותח לבאר עם דיסקציה ואמצעי הדמיה. לניסויי הדמיה ארוכים מ-3 שעות, יש להשתמש בדיסקציה ובאמצעי הדמיה בתוספת גופי שומן כמתואר לעיל. נתחו את הזחלים בקבוצות כדי לשמור על זמן הדיסקציה מתחת ל-20 דקות.

5. הרכבה והדמיה (איור 4)

1. להדמיה עם שקופית³⁴ הקשורה לקרום:
   1. אספו גם מוחות מנותחים וגם גופי שומן מבודדים בבאר האחרונה של צלחת הדיסקציה.
   2. הרכיבו מחצית מהמגלשה על-ידי הנחת קרום חדיר גז על גב המגלשה, ולחצו על הטבעת המפוצלת במרכז, תוך החזקתה במקומה (איור 4A-C).
   3. באמצעות מיקרופיפטה של 200 μL, העבר עד 10 מוחות מנותחים וכמה שיותר גוף שומן (ראה לעיל) ב~ 130-140 μL של דיסקציה ואמצעי הדמיה לממברנה. הקפידו להפקיד את התווך עם הדגימות במרכז הממברנה החדירה לגז (איור 4D, E).
   4. כוונו את המוחות לצילום אוכלוסיית NBs ולסוג המיקרוסקופ שבו משתמשים (איור 4E). מקמו את הדגימה קרוב ככל האפשר למטרת המיקרוסקופ. לדוגמה, כדי לדמיין NBs באונות המוח המרכזיות, כוונו את המוחות כך שאונות המוח יהיו הקרובות ביותר למטרה (איור 4H).
   5. ברגע שהמוח מכוון, הניחו בעדינות כיסוי זכוכית על גבי התמיסה על הממברנה. זה יגרום לתמיסה שמכילה את המוח ואת גופי השומן להתפשט על פני כל הממברנה (איור 4F).
   6. כתם תמיסה מוגזמת על ידי החזקת רקמת מעבדה קרוב לקצה הכיסוי. הכמות האופטימלית של תמיסה מושגת כאשר המוח נוגע בכיסוי מבלי להימעך. אם נדרשת התמצאות מחדש בשלב זה, הזיזו בזהירות את הכיסוי כדי להזיז את המוח.
   7. יש לשתק את הכיסוי על ידי מריחת ג'ל פטרולאום מומס לאורך קצוות הכיסוי בעזרת מכחול. אפשרו לג'לי להתמצק (איור 4G).
2. להדמיה עם שקופית הדמיה מרובת בארות (איור 4):
   1. הוסף 400 μL של אמצעי הדמיה לבאר של שקופית מרובת בארות (בניסוי שבוצע כאן, נעשה שימוש בשקופית מיקרו[μ] קאמרית; איור 4I). העבירו את גופי השומן שנותחו בעבר לבאר זו (ראו שלב 3.4).
   2. הפקדת עד 10 מוחות בצביר ליד מרכז הבאר (איור 4J).
   3. כוונו את המוחות לצילום אוכלוסיית NBs ולסוג המיקרוסקופ שבו משתמשים, כפי שמתואר בשלב 5.1.4 (איור 4K). סדרו את הדגימות כך שיהיו קרובות זו לזו. פעולה זו תמזער את המרחק שהבמה צריכה לעבור בין דגימות, מה שיפחית את סחף הדגימה במהלך הרכישה.
   4. לאחר שהמוחות מכוונים לבאר, אפשרו למוח להסתפק במשך 2-5 דקות. זה מגביר את יציבותם במהלך הובלה/הדמיה. הכינו את המיקרוסקופ לרכישה בתקופה זו.
   5. כסו את המגלשה μ בכיסוי השקופית והעבירו אותה למיקרוסקופ. התחל ברכישה עם עוצמת הלייזר וזמן החשיפה הנמוכים ביותר האפשריים כדי למזער את ההלבנה.

6. שיטות עבודה מומלצות לעיבוד וניהול נתונים

1. עבד את הנתונים לפי הצורך בהתאם לתוכנת הניתוח הזמינה.
   1. עבור הדוגמה המוצגת כאן, שמור את הנתונים שנרכשו באמצעות תוכנת SlideBook כקובץ תמונה של SlideBook ( .sld).
   2. כדי להמיר לסוג הקובץ הקנייני של Imaris ( .ims) באמצעות Imaris File Converter, פתח את Imaris File Converter בחלון נפרד. לחץ על וגרור את קבצי ה- .sld לקטע "קלט" של ממיר הקבצים Imaris.
   3. קבע את מיקום הפלט הרצוי עבור הקבצים שהומרו ולחץ על "התחל הכל".
   4. לאחר ההמרה, הצג והוסף ביאורים לנתונים בתוכנת Imaris.
      הערה: ניתן להשתמש בחלופות לניתוח תמונות במקום Imaris, כגון פיג'י (https://hpc.nih.gov/apps/Fiji.html), Aivia (https://www.aivia-software.com/), Volocity (https://www.volocity4d.com/) או אחרות.
2. שמור כמה שיותר מהנתונים המקוריים לצורך שמירת רשומות נאותה. לדוגמה, אם תוכנת הרכישה נשמרת בתבנית קובץ אחת אך מומרת לתבנית אחרת לצורך ניתוח, שמור על הגרסה שנרכשה של הנתונים.
3. לצורך ניתוח נתונים, שמור תיעוד של פרטים רבים ככל האפשר על הגדרות הדגימה והרכישה. מידע מרכזי שיש לשמור כולל את הגנוטיפ של הזחלים המנותחים, גיל הזחלים לפני הנתיחה, מצב פקק הארוחה שבו גדלו, כוח הלייזר ששימש במהלך ההדמיה, זמן החשיפה, משך הרכישה והרזולוציה הזמנית.

7. כימות לדוגמה של אורך מחזור התא (איור 5)

הערה: בדוגמה זו צולמו זחלים המבטאים את סמן הקוטביות Pins (Pins::EGFP¹⁶) ואת החלבון קושר המיקרוטובולים Jupiter²⁵ (דובדבן::יופיטר¹³). הניתוח הבא בוצע באמצעות תוכנת אימריס.

1. פתח את הסרט באמצעות תוכנת ניתוח התמונות הנבחרת. גלול לאורך הסרט כדי לזהות NBs מחולקים, ותייג אותם לעיון עתידי. זהו את ה-NBs המתחלקים לפי הצירים המיטוטיים, הנפרדים שלהם (איור 5C-E).
2. זהה שלב מחזור תא התייחסות כדי לקבוע את אורך מחזור התא. בדוגמה זו, metaphase משמש כהפניה.
3. קבע ידנית את מספר המסגרות בין מטא-פאזות עוקבות, והמר אותו לדקות או לשעות כדי לקבוע את הזמן הדרוש להשלמת מחזור תא אחד.
   1. עשו זאת על ידי לקיחת הרזולוציה הזמנית של הסרט והכפלתה במספר הפריימים בין מטאפאזות. לדוגמה, אם הרזולוציה הטמפורלית של הסרט היא פריים אחד בכל 5 דקות, ומטאפאזות נצפות בפריים 13 ובפריים 35, הזמן בין מטאפאזות אלה יהיה 110 דקות ([35 − 13] × 5).
4. התווה את הנתונים עם כל תוכנה מתאימה. הנתונים המוצגים כאן שורטטו באמצעות תוכנת PRISM.

8. כימות לדוגמה של יישור ציר התא (איור 5)

הערה: בדוגמה זו, הניתוח מתבצע באמצעות תוכנת Imaris.

1. פתח את קובץ הסרט ב- Imaris או בתוכנה אחרת לבחירה. גלול לאורך הסרט כדי לזהות NBs מחולקים, ותייג אותם לעיון עתידי.
2. קבע את הווקטור שנוצר על ידי מוטות הציר באמצעות הצנטרוזומים האפיקליים והבזאליים (המיוצגים על ידי m), כדלקמן:
   
   כאשר Ax, Ay ו- Az הן הקואורדינטות של הצנטרוזום האפיקאלי, ו- Bx, By ו- Bz הן הקואורדינטות של הצנטרוזומים הבסיסיים. באופן דומה, ציר וקטור החלוקה (המיוצג על ידי n) נוצר על ידי נקודת האמצע של הסיכות האפיות::EGFP סהר וקליפת המוח הבסיסית:
   
   כאשר Ax, Ay ו-Az הן הקואורדינטות של נקודת האמצע של הפינים::EGFP סהר, ו-Bx, By ו-Bz הן הקואורדינטות של נקודת האמצע של קליפת המוח הבסיסית.
3. קבע את גודל הווקטורים m ו - n:
   גודל של m:
   גודל n:
4. קבע את מכפלת הנקודות (המיוצגת על ידי k) של m ו - n:
   
5. באמצעות מכפלת הנקודות k והגדלים הווקטוריים m ו-n, לקבוע את הזווית בין הווקטורים:
   
6. התווה את הנתונים בתוכנה הנבחרת. הנתונים המוצגים כאן הוכנו ב- Microsoft Excel והוצגו באופן חזותי ב- PRISM.

תוצאות

דיסקציה והדמיה של NBs של אונת המוח המרכזית המבטאים סיכות::EGFP ודובדבן::יופיטר
כדי להציג את הפרוטוקול הזה, הזחלים מבטאים דובדבן מונע כטב"ם::יופיטר¹³ ומתויגים אנדוגנית סיכות::EGFP¹⁶ (w; worGal4, UAS-cherry::jupiter/CyO; פינים::EGFP/TM6B, Tb) צולמו במשך 4 שעות באמצעות הפרוטוקול המתואר ב...

Discussion

פרוטוקול זה מתווה גישה אחת לדימות של מוחות צמחים חיים מזחלי Drosophila melanogaster . הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר לצפות במוחות של צמחים במשך 12-20 שעות בתנאי הניסוי המתאימים. יש לתת תשומת לב מיוחדת להכנת הדגימות ולתכנון הניסויים הרצויים. כאמור, אחד הגורמים הקריטיים ביותר הקובעים את איכות הרקמה המנ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm polyethersulfone (PES) Membrane	Genesee	25-231	Vacuum-driven filters
Agar	Genesee	20-248	granulated agar
Analytical Computer	Dell	NA	Intel Xeon Gold 5222 CPU with two 3.80 GHz processors running Windows 10 on a 64-bit operating system
Bovine Growth Serum	HyClone	SH30541.02
Chambered Imaging Slides	Ibidi	80826
Confocal Microscope	Nikon	NA
Custom-machined metal slide	NA	NA	See Cabernard and Doe 2013 (Ref. 34) for specifications
Dissection Dishes	Fisher Scientific	5024343	3-well porcelain micro spot plate
Dissection Forceps	World Precision Instruments	Dumont #5
Dissection Microscope	Leica	NA
Dissection Scissors	Fine Science Tools (FST)	15003-08
Embryo collection cage	Genesee	59-100
Flypad with access to CO2 to anesthetize adult flies	Genesee	59-172
Gas-permeable membrane	YSI	98095	Gas-permeable membrane
Glass Cover Slides	Electron Microscopy Sciences	72204-03	# 1.5; 22 mm x 40 mm glass coverslips
Imaris	Oxford Instruments	NA	Alternatives: Fiji, Volocity, Aivia
Imaris File Converter	Oxford Instruments	NA
Instant Yeast	Saf-Instant	NA
Molasses	Genesee	62-117
Petri dish	Greiner Bio-One	628161	60 mm x 15 mm Petri dish
Petroleum Jelly	Vaseline	NA
Schneider's Insect Medium with L-glutamine and sodium bicarbonate liquid	Millipore Sigma	S0146
SlideBook acquisition software	3i	NA
Vacuum-Driven Filtration Unit with a 0.22 µµm PES membrane filter	Genesee Scientific, GenClone	25-231