تحليل بروتين الخلية المضيفة باستخدام حبات التخصيب إلى جانب الهضم المحدود

Summary

يتم تقديم بروتوكول لإثراء بروتينات الخلايا المضيفة (HCPs) من المنتجات الدوائية (DP) والكشف عن الببتيدات باستخدام حبات إثراء البروتين. يتم عرض الطريقة باستخدام مادة دواء الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAb) المصنعة داخليا (DS) ، وهي مادة مرجعية جيدة المواصفات لتقييم ومقارنة الطرق المختلفة من حيث الأداء.

Abstract

بروتينات الخلايا المضيفة (HCPs) هي شوائب يمكن أن تؤثر سلبا على البروتينات العلاجية ، حتى بكميات صغيرة. لتقييم المخاطر المحتملة المرتبطة بالمنتجات الدوائية ، تم تطوير طرق لتحديد HCPs منخفضة الوفرة. يتضمن النهج الحاسم لتطوير طريقة حساسة للكشف عن HCP إثراء HCPs مع إزالة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAbs) في نفس الوقت قبل التحليل ، باستخدام قياس الطيف الكتلي اللوني السائل (LC-MS).

يقدم هذا البروتوكول تعليمات مفصلة لإثراء بروتينات الخلية المضيفة باستخدام حبات تخصيب البروتين المتاحة تجاريا. تحتوي هذه الخرزات على مكتبة متنوعة من روابط سداسي الببتيد ذات صلات محددة للبروتينات المختلفة. يتضمن البروتوكول أيضا الهضم المحدود والكشف اللاحق عن الببتيد باستخدام NANO LC-MS / MS. من خلال استخدام هذه التقنيات ، يمكن إثراء HCPs ذات الوفرة المنخفضة بأكثر من 7000 ضعف ، مما يؤدي إلى حد اكتشاف مثير للإعجاب يصل إلى 0.002 جزء في المليون. بشكل ملحوظ ، يتيح هذا البروتوكول اكتشاف 850 HCPs بمستوى عال من الثقة باستخدام NIST mAb. علاوة على ذلك ، تم تصميمه ليكون سهل الاستخدام ويتضمن عرضا توضيحيا بالفيديو للمساعدة في تنفيذه. باتباع هذه الخطوات ، يمكن للباحثين إثراء واكتشاف HCPs بشكل فعال ، مما يعزز حساسية ودقة تقييم المخاطر للمنتجات الدوائية.

Introduction

بروتينات الخلية المضيفة (HCPs) هي شوائب يتم إطلاقها من زراعة الخلايا للكائن الحي المضيف ويتم تنقيتها بشكل مشترك باستخدام الجسم المضاد وحيد النسيلة (mAb)¹،²،^3،4. يمكن أن تؤثر مستويات التتبع من HCPs سلبا على جودة منتج الدواء⁵،⁶،⁷،⁸،⁹،^10،11،12،¹³،¹⁴،¹⁵ ، وبالتالي ....

Protocol

الاختصارات المستخدمة في البروتوكول مدرجة في الجدول التكميلي 1.

1. إعداد الحلول والمخازن المؤقتة

ملاحظة: يتم سرد التفاصيل التجارية لجميع الكواشف في جدول المواد.

1. قم بإعداد محلول 0.1 M Tris-HCl ، pH 8.0 بإضافة 1 مل من 1 M Tris-HCl ، ودرجة الحموضة 8.0 إلى 9 مل من الماء منزوع الأيونات في قنينة زجاجية ، واخلطها جيدا عن طريق الدوامة. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
2. تحضير 24 mM deoxycholate الصوديوم (SDC) عن طريق إذابة 10 ملغ من SDC في 1 مل من 0.1 M Tris-HCl ، درجة الحموضة 8.0.
3. تحضير 24 مليمتر الصوديوم لورويل ساركوسينات....

النتائج

قدم هذا البروتوكول سير عمل لإعداد العينة ، يسمى إثراء البروتين إلى جانب الهضم المحدود (PMLD) ، لتحليل بروتينات الخلية المضيفة (HCPs) في عينة من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAb). يوضح الشكل 1 الإجراء التدريجي ل PMLD. قارن الباحثون نتائج تحليل HCP باستخدام الهضم المباشر (كما هو موضح ف.......

Discussion

هناك نسختان من حبات تخصيب البروتين المتاحة تجاريا: واحدة بسعة أصغر والأخرى بسعة أكبر (انظر جدول المواد). يحتوي كلا الإصدارين من حبات التخصيب على عشرة تحضيرات في العبوة. تشير تعليمات الشركة المصنعة إلى أنه يمكن استخدام كل تحضير من مجموعة السعة الصغيرة لإثراء 10 ملغ من البروتين الكل?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3	Hamilton	91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm)	Thermo Fisher	164535
Acetonitrile	Fisher-Scientific	A955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade	Fisher-Scientific	LS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å)	CoAnn Technologies	HEB07503001718I
Centrifuge 5424	Eppendorf	5405000646
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher	A39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk	Agilent	12131020
GL-Tip GC	GL Sciences Inc	7820-11201
in-house mAb	Regeneron		concentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg)	Thermo Fisher	A39271
Isopropanol	Fisher-Scientific	149320025
L-Histidine	Sigma Aldrich	H6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrate	Sigma Aldrich	53370
Methanol	Fisher-Scientific	A456-4
Milli-Q	Millpore	30035
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000
Orbitrap Exploris 480	Thermo Fisher	BRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mL	Eppendorf (VWR)	22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mL	Eppendorf (VWR)	22431102
Proteome Discoverer software 2.4	Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit	Bio-Rad	1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit	Bio-Rad	1633006
Sodium deoxycholate (SDC)	Sigma Aldrich	D6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS)	Sigma Aldrich	L5777
SpeedVac	Labconco	7970010
Thermomixer R	Eppendorf	22670107
Trifluoracetic acid (TFA)	Fisher-Scientific	28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug)	Promega	V5111
Tube Revolver Rotator	Thermo Fisher	88881001
UltiMate 3000 RSLC nano system	Thermo Fisher	ULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0	Thermo Fisher	15568-025
Vortex Genie 2	VWR	102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade	Fisher-Scientific	LS118-4