Analyse von Wirtszellproteinen unter Verwendung von Anreicherungskügelchen in Verbindung mit begrenztem Verdau

Zusammenfassung

Es wird ein Protokoll zur Anreicherung von Wirtszellproteinen (HCPs) aus Arzneimitteln (DP) und zum Nachweis von Peptiden mit Hilfe von Proteom-Anreicherungskügelchen vorgestellt. Die Methode wird anhand eines selbst hergestellten monoklonalen Antikörpers (mAb) Drug Substance (DS) demonstriert, der ein gut charakterisiertes Referenzmaterial für die Bewertung und den Vergleich verschiedener Methoden in Bezug auf die Leistung darstellt.

Zusammenfassung

Wirtszellproteine (HCPs) sind Verunreinigungen, die sich bereits in geringen Mengen negativ auf therapeutische Proteine auswirken können. Um die potenziellen Risiken im Zusammenhang mit Arzneimitteln zu bewerten, wurden Methoden entwickelt, um HCPs mit geringer Häufigkeit zu identifizieren. Ein entscheidender Ansatz für die Entwicklung einer sensitiven HCP-Nachweismethode besteht darin, HCPs anzureichern und gleichzeitig monoklonale Antikörper (mAbs) vor der Analyse mit Hilfe der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) zu entfernen.

Dieses Protokoll bietet detaillierte Anweisungen zur Anreicherung von Wirtszellproteinen mit kommerziell erhältlichen Proteom-Anreicherungskügelchen. Diese Kügelchen enthalten eine vielfältige Bibliothek von Hexapeptid-Liganden mit spezifischen Affinitäten für verschiedene Proteine. Das Protokoll umfasst auch einen begrenzten Aufschluss und die anschließende Peptiddetektion mittels Nano-LC-MS/MS. Durch den Einsatz dieser Techniken können HCPs mit geringer Häufigkeit über 7000-fach angereichert werden, was zu einer beeindruckenden Nachweisgrenze von nur 0,002 ppm führt. Bezeichnenderweise ermöglicht dieses Protokoll die Erkennung von 850 HCPs mit einem hohen Maß an Zuverlässigkeit unter Verwendung eines NIST-mAbs. Darüber hinaus ist es benutzerfreundlich gestaltet und enthält eine Videodemonstration, die bei der Implementierung hilft. Durch die Befolgung dieser Schritte können Forscher HCPs effektiv anreichern und nachweisen und so die Sensitivität und Genauigkeit der Risikobewertung für Arzneimittel verbessern.

Einleitung

Wirtszellproteine (HCPs) sind Verunreinigungen, die aus der Zellkultur des Wirtsorganismus freigesetzt und mit monoklonalen Antikörpern (mAb) gereinigt werden1,2,3,4. Spurenkonzentrationen von HCPs können sich negativ auf die Qualität des Arzneimittels^auswirken 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15^<....

Protokoll

Die im Protokoll verwendeten Abkürzungen sind in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführt.

1. Herstellung von Lösungen und Puffern

HINWEIS: Die kommerziellen Details aller Reagenzien sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Bereiten Sie 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0 Lösung vor, indem Sie 1 ml 1 M Tris-HCl, pH 8,0 in 9 ml deionisiertes Wasser in einem Glasfläschchen hinzufügen und durch Wirbeln gut mischen. Bei 4 °C bis zu 3 Monate lagern.
2. Bereiten Sie 24 mM Natriumdesoxycholat (SDC) vor, indem Sie 10 mg SDC in 1 ml 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0 auflösen.
<....

Diskussion

Es gibt zwei Versionen von kommerziell erhältlichen Proteinanreicherungskügelchen: eine mit kleinerer Kapazität und die andere mit größerer Kapazität (siehe Materialtabelle). Beide Versionen der Anreicherungsperlen enthalten zehn Preps in der Packung. Die Anweisungen des Herstellers deuten darauf hin, dass jedes Präparat aus dem Kit mit geringer Kapazität verwendet werden kann, um 10 mg Gesamtprotein anzureichern. Für eine optimale Leistung der Anreicherung von Wirtszellproteinen (HCP) durch DS .......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3	Hamilton	91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm)	Thermo Fisher	164535
Acetonitrile	Fisher-Scientific	A955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade	Fisher-Scientific	LS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å)	CoAnn Technologies	HEB07503001718I
Centrifuge 5424	Eppendorf	5405000646
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher	A39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk	Agilent	12131020
GL-Tip GC	GL Sciences Inc	7820-11201
in-house mAb	Regeneron		concentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg)	Thermo Fisher	A39271
Isopropanol	Fisher-Scientific	149320025
L-Histidine	Sigma Aldrich	H6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrate	Sigma Aldrich	53370
Methanol	Fisher-Scientific	A456-4
Milli-Q	Millpore	30035
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000
Orbitrap Exploris 480	Thermo Fisher	BRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mL	Eppendorf (VWR)	22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mL	Eppendorf (VWR)	22431102
Proteome Discoverer software 2.4	Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit	Bio-Rad	1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit	Bio-Rad	1633006
Sodium deoxycholate (SDC)	Sigma Aldrich	D6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS)	Sigma Aldrich	L5777
SpeedVac	Labconco	7970010
Thermomixer R	Eppendorf	22670107
Trifluoracetic acid (TFA)	Fisher-Scientific	28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug)	Promega	V5111
Tube Revolver Rotator	Thermo Fisher	88881001
UltiMate 3000 RSLC nano system	Thermo Fisher	ULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0	Thermo Fisher	15568-025
Vortex Genie 2	VWR	102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade	Fisher-Scientific	LS118-4