Анализ белка клетки-хозяина с использованием гранул обогащения в сочетании с ограниченным пищеварением

Резюме

Представлен протокол обогащения белков клетки-хозяина (ГКП) из лекарственных препаратов (ЛП) и детекции пептидов с помощью гранул обогащения протеома. Метод демонстрируется с использованием лекарственной субстанции (DS) моноклонального антитела (мАТ) собственного производства, которая является хорошо охарактеризованным эталонным материалом для оценки и сравнения различных методов с точки зрения эффективности.

Аннотация

Белки клетки-хозяина (HCP) представляют собой примеси, которые могут отрицательно влиять на терапевтические белки даже в небольших количествах. Для оценки потенциальных рисков, связанных с лекарственными препаратами, были разработаны методы выявления медицинских работников с низкой численностью. Важнейший подход к разработке чувствительного метода обнаружения ГКП включает обогащение СГП с одновременным удалением моноклональных антител (мАТ) перед анализом с использованием жидкостной хромато-масс-спектрометрии (ЖХ-МС).

Этот протокол предлагает подробные инструкции по обогащению белков клетки-хозяина с помощью коммерчески доступных гранул обогащения протеома. Эти бусины содержат разнообразную библиотеку гексапептидных лигандов со специфическим сродством к различным белкам. Протокол также включает ограниченное пищеварение и последующее обнаружение пептидов с помощью нано-ЖХ-МС/МС. Используя эти методы, медицинские работники с низкой концентрацией могут быть обогащены более чем в 7000 раз, что приводит к впечатляющему пределу обнаружения до 0,002 ppm. Важно отметить, что этот протокол позволяет обнаруживать 850 медицинских работников с высоким уровнем достоверности с помощью мАТ NIST. Кроме того, он разработан так, чтобы быть удобным для пользователя, и включает в себя видеодемонстрацию, чтобы помочь в его реализации. Выполняя эти шаги, исследователи могут эффективно обогащать и выявлять медицинских работников, повышая чувствительность и точность оценки риска для лекарственных препаратов.

Введение

Белки клетки-хозяина (HCP) представляют собой примеси, которые высвобождаются из клеточной культуры организма-хозяина и совместно очищаются с моноклональными антителами (mAb)1,2,3,4. Следовые уровни ГКП могут негативно влиять на качество лекарственного препарата 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15

протокол

Аббревиатуры, используемые в протоколе, приведены в дополнительной таблице 1.

1. Приготовление растворов и буферов

ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческие данные всех реагентов указаны в таблице материалов.

1. Приготовьте 0,1 М раствора Tris-HCl, pH 8,0, добавив 1 мл 1 M Tris-HCl, pH 8,0 в 9 мл деионизированной воды в стеклянном флаконе, и хорошо перемешайте путем вихряния. Хранить при температуре 4 °C до 3 месяцев.
2. Приготовьте 24 мМ дезоксихолата натрия (SDC), растворив 10 мг SDC в 1 мл 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0.
3. Приготовьте 24 мМ лауроилсаркозината нат....

Результаты

В этом протоколе представлен рабочий процесс подготовки образцов, называемый обогащением белка в сочетании с ограниченным пищеварением (PMLD), для анализа белков клетки-хозяина (HCP) в образце моноклонального антитела (mAb). На рисунке 1 показана пошаговая процедура PMLD. Иссле.......

Обсуждение

Существует две версии коммерчески доступных гранул для обогащения белком: одна с меньшей емкостью, а другая с большей емкостью (см. Таблицу материалов). Обе версии бусин для обогащения содержат в упаковке по десять препов. Инструкция производителя предполагает, что каждый преп.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3	Hamilton	91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm)	Thermo Fisher	164535
Acetonitrile	Fisher-Scientific	A955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade	Fisher-Scientific	LS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å)	CoAnn Technologies	HEB07503001718I
Centrifuge 5424	Eppendorf	5405000646
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher	A39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk	Agilent	12131020
GL-Tip GC	GL Sciences Inc	7820-11201
in-house mAb	Regeneron		concentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg)	Thermo Fisher	A39271
Isopropanol	Fisher-Scientific	149320025
L-Histidine	Sigma Aldrich	H6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrate	Sigma Aldrich	53370
Methanol	Fisher-Scientific	A456-4
Milli-Q	Millpore	30035
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000
Orbitrap Exploris 480	Thermo Fisher	BRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mL	Eppendorf (VWR)	22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mL	Eppendorf (VWR)	22431102
Proteome Discoverer software 2.4	Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit	Bio-Rad	1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit	Bio-Rad	1633006
Sodium deoxycholate (SDC)	Sigma Aldrich	D6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS)	Sigma Aldrich	L5777
SpeedVac	Labconco	7970010
Thermomixer R	Eppendorf	22670107
Trifluoracetic acid (TFA)	Fisher-Scientific	28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug)	Promega	V5111
Tube Revolver Rotator	Thermo Fisher	88881001
UltiMate 3000 RSLC nano system	Thermo Fisher	ULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0	Thermo Fisher	15568-025
Vortex Genie 2	VWR	102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade	Fisher-Scientific	LS118-4