АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Представлен протокол обогащения белков клетки-хозяина (ГКП) из лекарственных препаратов (ЛП) и детекции пептидов с помощью гранул обогащения протеома. Метод демонстрируется с использованием лекарственной субстанции (DS) моноклонального антитела (мАТ) собственного производства, которая является хорошо охарактеризованным эталонным материалом для оценки и сравнения различных методов с точки зрения эффективности.

Аннотация

Белки клетки-хозяина (HCP) представляют собой примеси, которые могут отрицательно влиять на терапевтические белки даже в небольших количествах. Для оценки потенциальных рисков, связанных с лекарственными препаратами, были разработаны методы выявления медицинских работников с низкой численностью. Важнейший подход к разработке чувствительного метода обнаружения ГКП включает обогащение СГП с одновременным удалением моноклональных антител (мАТ) перед анализом с использованием жидкостной хромато-масс-спектрометрии (ЖХ-МС).

Этот протокол предлагает подробные инструкции по обогащению белков клетки-хозяина с помощью коммерчески доступных гранул обогащения протеома. Эти бусины содержат разнообразную библиотеку гексапептидных лигандов со специфическим сродством к различным белкам. Протокол также включает ограниченное пищеварение и последующее обнаружение пептидов с помощью нано-ЖХ-МС/МС. Используя эти методы, медицинские работники с низкой концентрацией могут быть обогащены более чем в 7000 раз, что приводит к впечатляющему пределу обнаружения до 0,002 ppm. Важно отметить, что этот протокол позволяет обнаруживать 850 медицинских работников с высоким уровнем достоверности с помощью мАТ NIST. Кроме того, он разработан так, чтобы быть удобным для пользователя, и включает в себя видеодемонстрацию, чтобы помочь в его реализации. Выполняя эти шаги, исследователи могут эффективно обогащать и выявлять медицинских работников, повышая чувствительность и точность оценки риска для лекарственных препаратов.

Введение

Белки клетки-хозяина (HCP) представляют собой примеси, которые высвобождаются из клеточной культуры организма-хозяина и совместно очищаются с моноклональными антителами (mAb)1,2,3,4. Следовые уровни ГКП могут негативно влиять на качество лекарственного препарата 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, и поэтому для выявления СГП в уровнях от менее ppm до ppm необходим чувствительный метод анализа HCP.

Ортогональные методы могут быть применены для выявления СГП в низкой численности. Иммуноферментный анализ (ИФА) обычно используется для количественного определения общего количества ГЧП, а также может выявлять и количественно определять отдельных СГП при наличии соответствующих антител16. Однако выработка HCP-специфических антител является трудоемкой и трудоемкой. В отличие от этого, жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией (ЖХ-МС) может предоставить исчерпывающую информацию об отдельных ГКП в лекарственных препаратах мАТ и широко применяется для идентификации ГКП 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20. 21,22,23,24,25,26,27.

Для выявления ГКП с ЖХ-МС/МС было разработано несколько методов, включая ограниченное пищеварение20, фильтрацию17, делецию белка А21, иммунопреципитацию (IP) и обогащение ProteoMiner (PM)18. Большинство методов направлены на уменьшение количества мАТ и обогащение ГКП перед анализом ЖХ-МС/МС, тем самым уменьшая динамический диапазон между пептидами мАТ и пептидами ГКП. Этот протокол представляет собой метод обогащения протеомных образцов, который сочетает в себе технологию ProteoMiner и ограниченное разложение (PMLD)28. Принцип обогащения ProteoMiner включает в себя использование коммерчески доступных гранул обогащения протеома, содержащих разнообразную библиотеку комбинаторных пептидных лигандов. Эти лиганды специфически связываются с белками на антителах-лекарственных продуктах, позволяя удалять избыточные молекулы, концентрируя белки клеток-хозяев с низкой численностью (HCP) на соответствующих аффинных лигандах. С другой стороны, принцип ограниченного пищеварения предполагает использование низкой концентрации трипсина. Эта концентрация достаточна для переваривания медицинских работников с низким содержанием, но недостаточна для переваривания всех лекарственных препаратов на основе антител. Такой подход позволяет извлекать и обогащать из раствора переваренные пептиды HCP.

По сравнению с методами фильтрации, методика PMLD не ограничена размером обнаруживаемых СГП17. Методы делеции белка А специфичны для выявления ГКП, ассоциированных с антителами21, в то время как иммунопреципитация ограничена заранее определенными ГКП из определенной клеточной линии (например, клеточной линии яичника китайского хомяка (СНО), где было выработано антитело к ГКП4. В отличие от этого, PMLD может быть применен для обнаружения HCP из любых лекарственных модулей и белков клетки-хозяина, совместно очищенных с лекарственными препаратами из различных клеточных линий. Кроме того, PMLD проявляет лучшую чувствительность по сравнению с упомянутыми методами 17,18,20,21,24.

Такой подход позволяет обогатить концентрацию ГКП в 7000 раз и снизить предел обнаружения до 0,002 ppm28. Экспериментальная установка показана на рисунке 1.

протокол

Аббревиатуры, используемые в протоколе, приведены в дополнительной таблице 1.

1. Приготовление растворов и буферов

ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческие данные всех реагентов указаны в таблице материалов.

  1. Приготовьте 0,1 М раствора Tris-HCl, pH 8,0, добавив 1 мл 1 M Tris-HCl, pH 8,0 в 9 мл деионизированной воды в стеклянном флаконе, и хорошо перемешайте путем вихряния. Хранить при температуре 4 °C до 3 месяцев.
  2. Приготовьте 24 мМ дезоксихолата натрия (SDC), растворив 10 мг SDC в 1 мл 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0.
  3. Приготовьте 24 мМ лауроилсаркозината натрия (SLS), растворив 7 мг SLS в 1 мл 0,1 М Tris-HCl, pH 8,0.
  4. Приготовьте элюирующий буфер, смешав 24 мМ SDC и 24 мМ SLS в соотношении 1:1 (v/v).
  5. Приготовьте 50 нг/мкл раствора трипсина, добавив 400 мкл деионизированной воды в 20 мкг трипсина.
  6. Приготовьте 25 мг/мл дитиотрейтола (ДТТ), добавив 308 мкл 0,1 М трис-HCl, рН 8,0, в 7,7 мг ДТТ.
  7. Приготовьте 0,25 М йодоацетамида (IAM), добавив 1,2 мл 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, в 56 мг IAM.
  8. Приготовьте 10% ТЖК, добавив 1 мл трифторуксусной кислоты (ТЖК) в 9 мл деионизированной воды. Вихрь в течение 4 с и вращение вниз. Хранить при температуре 4 °C до 3 месяцев.
  9. Приготовьте буфер А, добавив 1 мл 10% ТЖК в 99 мл деионизированной воды.
  10. Приготовьте буфер B, добавив 1 мл 10% ТЖК и 49 мл деионизированной воды в 50 мл ацетонитрила (ACN).
  11. Приготовьте 10 мМ гистидинового буфера, добавив 37 мг L-гистидина и 54,8 мг L-гистидина моногидрохлорида моногидрата в 50 мл воды.

2. Приготовление растворов моноклональных антител (мАТ)

  1. Для лекарственных препаратов с концентрациями выше 50 мг/мл разбавляют 15 мг моноклонального антитела (мАТ) (см. таблицу материалов) деионизированной водой в пробирке микроцентрифуги объемом 2 мл, в результате чего общий объем составляет 300 мкл, а конечный рН составляет ~6. При необходимости отрегулируйте рН с помощью уксусной кислоты или Tris-HCl.
  2. Для лекарственных препаратов с концентрациями ниже 50 мг/мл проводят буферную замену, следуя шагам 2.2.1 - 2.2.5.
    1. Переложите 20 мг каждого образца в центробежный фильтр 10k (см. таблицу материалов) и центрифугу при 14 000 x g в течение 25 минут (при комнатной температуре, RT) до тех пор, пока не останется объем примерно 100 мкл.
    2. Добавьте 350 мкл 10 мМ гистидина (см. Таблицу материалов), буфера pH 6,0 в фильтр, вихрь и центрифугу при 14 000 x g в течение 25 мин при RT. Повторите один раз.
    3. Переверните фильтр и поместите его в пробирку для сбора проб, затем центрифугируйте образцы при 1000 x g в течение 5 минут при RT, чтобы извлечь весь объем в пробирке для сбора. Промойте фильтр гистидиновым буфером объемом 200 мкл 10 мМ и пипетируйте вверх и вниз, чтобы собрать оставшиеся образцы белка. Перелейте весь раствор в ту же сборную трубку, закрутите и открутите вниз.
    4. Измерьте концентрацию образца с помощью NanoDrop. Отрегулируйте концентрацию каждого образца белка до 50 мг/мл, добавив гистидиновый буфер перед инкубацией с гранулами для обогащения.
    5. Перелейте 300 мкл образца в пробирку для микроцентрифуги объемом 2 мл.

3. Приготовление гранул обогащения протеома

  1. Снимите верхнюю и нижнюю крышки с каждой колонки для отжима, полученной из коммерческого набора для обогащения белка (см. Таблицу материалов). Не выбрасывайте колпачки, так как они будут использоваться позже.
  2. Возьмите спин-колонку и поместите ее в пробирку для микроцентрифуги объемом 2 мл без крышки. Центрифугируйте установку при комнатной температуре и 1 000 x g в течение 30-60 с при RT, чтобы исключить решение для хранения. Утилизируйте материал, собранный на этом этапе.
  3. Добавьте 200 мкл промывочного буфера к имеющимся в продаже гранулам обогащения (см. таблицу материалов) и несколько раз пропитывайте вверх и вниз. Поместите спиновую колонку в пробирку для микроцентрифуги объемом 2 мл и центрифугируйте при 1,000 x g в течение 30-60 с при RT, чтобы удалить буфер. Выбросьте собранный материал.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Промывочный буфер входит в коммерческий набор для обогащения белка.
  4. Повторите шаги 3.3 дважды.
  5. Установите нижний колпачок на место и добавьте 200 мкл воды, затем установите верхний колпачок.

4. Обогащение белком

  1. Пипетируйте суспензию вверх и вниз (начиная с шага 3,5) и перенесите 40 мкл суспензии в образец, подготовленный на шаге 2. Инкубируйте и вращайте пробирку при комнатной температуре в течение 2 ч.
  2. Сделайте наконечник с фритвой (см. Таблицу материалов) с помощью иглы 16 G, чтобы получить подходящий размер фритты, затем вставьте его в конец наконечника наконечника объемом 200 мкл.
  3. Перенесите образец с бисером на наконечник, подготовленный на шаге 4.2. Центрифугируйте наконечник с помощью микроцентрифужной пробирки объемом 2 мл при 200 x g в течение 3 мин при RT для удаления раствора.
  4. Промойте шарики, добавив 200 мкл промывочного буфера к наконечнику, и центрифугируйте наконечник с помощью микроцентрифужной пробирки объемом 2 мл при 200 x g в течение 2 минут при RT для удаления моющего раствора. Повторите шаг дважды.
  5. Промойте шарики, добавив 200 мкл воды в наконечник, и центрифугируйте наконечник с помощью пробирки микроцентрифуги объемом 2 мл при 200 x g в течение 2 минут при RT, чтобы удалить воду.
  6. Элюируйте белки из шариков, добавив 10 мкл элюирующего буфера (шаг 1.4) в наконечник, и пипетируйте суспензию десять раз в наконечнике, чтобы убедиться, что гранулы пропитаны элюирующим буфером.
  7. Центрифугируйте наконечник с помощью новой микроцентрифужной пробирки объемом 0,5 мл при 200 x g в течение 30 с при RT для сбора элюента. Повторите шаги 4,6-4,7 дважды и смешайте все элюирование в одну пробирку для микроцентрифуги объемом 0,5 мл.
  8. Добавьте 1,5 мкл раствора трипсина (шаг 1,5) в элюент для ночного разложения при 28 °C. Добавьте 1,5 мкл 25 мг/мл DTT (шаг 1,6) и нагрейте образец при 90 °C в течение 20 мин.
  9. Добавьте 1,5 мкл 0,25 М IAM (шаг 1,7) и инкубируйте при комнатной температуре в темноте в течение 20 мин. Добавьте 3,5 мкл 10% TFA (шаг 1,8), перемешайте в течение 2 мин и убедитесь, что pH составляет ~2-3.
  10. Центрифугу при 14 400 × г в течение 10 мин при RT для осаждения SDC и SLS. Соберите надосадочную жидкость для обессоливания.
  11. Выполните обессоливание, выполнив следующие действия.
    1. Добавьте 50 мкл буфера B (шаг 1.10) в наконечник для обессоливания GC (см. таблицу материалов). Центрифугируйте наконечник с держателем при 1000 x g в течение 3 мин при RT. Выбросьте собранный материал.
    2. Добавьте 50 мкл буфера А (шаг 1,9) к наконечнику. Центрифугируйте наконечник с держателем при 1000 x g в течение 3 мин при RT. Выбросьте собранный материал.
    3. Добавьте подкисленный образец к кончику. Центрифугируйте наконечник с держателем при 500 x g в течение 6 мин при RT. Выбросьте собранный материал.
    4. Вымойте наконечник, добавив в него 50 мкл буфера А. Центрифугируйте наконечник с держателем при 500 x g в течение 3 мин при RT. Выбросьте собранный материал. Повторите один раз.
    5. Элюируйте пептид из наконечника, добавив 50 мкл буфера B в наконечник для обессоливания GC. Центрифугируйте наконечник с новой пробиркой при 500 x g в течение 3 мин при RT. Соберите материал. Повторите этот шаг один раз и смешайте элюент.
    6. Высушите элюент с помощью вакуумного концентратора (см. Таблицу материалов).
  12. Высушенный элюент повторно суспендировать в 30 мкл 0,1% раствора муравьиной кислоты (ЖК).
  13. Измеряют УФ пептидных смесей на длине волны 214 нм спектрофотометром (см. таблицу материалов). Концентрация пептидных смесей должна колебаться от 0,1 до 0,5 мг/мл.
  14. Перелейте 10 мкл каждого переваренного образца во флакон с образцом LC, затем введите 1 мкг каждого расщепленного образца в nano LC-MS/MS (см. таблицу материалов). Выполните анализ, выполнив шаг 5. Остальные переваренные образцы храните в морозильной камере при температуре -80 °C.

5. Нано-ЖХ-МС/МС анализ

  1. Введите пептидную смесь в нано-LC-систему, соединенную с масс-спектрометром. Загрузите пептидные смеси (~1 мкг) в колонку-ловушку C18 с градиентом, указанным в таблице 1A для обессоливания, а затем в аналитическую колонку C18 при 40 °C для разделения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер подвижной фазы А состоял из 0,1% ЖК в сверхчистой воде, а подвижная фаза В состояла из 0,1% ЖК в 80% АКН.
  2. Разделяют пептиды и элюируют с градиентом, приведенным в таблице 1B , со скоростью потока 250 нл/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Масс-спектрометр эксплуатировался в информационно-зависимом режиме (ДДА) с временем цикла 3 с. Ионы подвергались фрагментации с помощью высокоэнергетической сударной диссоциации (HCD) с нормированной энергией столкновения 30% для каждого полного МС-сканирования. Сканирование проводилось с разрешением 60 000, с автоматической регулировкой усиления (АРУ) 3e6, максимальным временем впрыска 20 мс и диапазоном m/z 380-1600. События MS/MS проводились с разрешением 15 000, с целью AGC 1e5, максимальным временем впрыска 60 мс и диапазоном m/z 200-2000. Длительность исключения была установлена равной 45 с. Свойства источника ионов приведены в таблице 1C, а конкретные параметры масс-спектрометрии можно найти в таблице 2A-F.

6. Анализ данных

  1. Выполните поиск необработанных файлов масс-спектрометрии NISTmAb по базе данных UniProt mus+musculus29. Кроме того, выполните поиск необработанных файлов масс-спектрометрии рекомбинантного белка mAb DS в базе данных UniProt Cricetulus Griseus30.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти поиски проводились в программном обеспечении Proteome Discoverer (см. Таблицу материалов) с использованием поисковых систем Sequest HT и Mascot. Используемые базы данных не содержали избыточных записей.
  2. Для масс-спектрометрического поиска примените допуск массы 10 ppm и установите допуск массы фрагмента равным 0,02 Da.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Критерии поиска включали статическое карбамидометилирование остатков цистеина (+57,0214 Да) и вариабельную модификацию окисления (+15,9949 Да) на остатках метионина. Дополнительно применялась переменная модификация дезаминирования (+0,984 Да).
  3. Выполнить поиск в базе данных с помощью расщепления трипсина, допуская максимум два пропущенных расщепления. Установите частоту ложных открытий как для белков, так и для пептидов на уровне 0,01.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для положительной идентификации белков клетки-хозяина (HCP) применялось минимальное требование не менее двух уникальных пептидов. В таблице 3 приведена репрезентативная сводка идентифицированных HCP, ассоциированных с NIST mAb, проанализированных с помощью программного обеспечения Proteome Discoverer.

Результаты

В этом протоколе представлен рабочий процесс подготовки образцов, называемый обогащением белка в сочетании с ограниченным пищеварением (PMLD), для анализа белков клетки-хозяина (HCP) в образце моноклонального антитела (mAb). На рисунке 1 показана пошаговая процедура PMLD. Иссле...

Обсуждение

Существует две версии коммерчески доступных гранул для обогащения белком: одна с меньшей емкостью, а другая с большей емкостью (см. Таблицу материалов). Обе версии бусин для обогащения содержат в упаковке по десять препов. Инструкция производителя предполагает, что каждый преп...

Раскрытие информации

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Никакой.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3Hamilton91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm)Thermo Fisher164535
AcetonitrileFisher-ScientificA955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade Fisher-ScientificLS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter UnitMillipore SigmaUFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å)CoAnn TechnologiesHEB07503001718I
Centrifuge 5424Eppendorf5405000646
Dithiothreitol (DTT) Thermo FisherA39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pkAgilent12131020
GL-Tip GCGL Sciences Inc  7820-11201
in-house mAbRegeneronconcentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg)Thermo FisherA39271
IsopropanolFisher-Scientific149320025
L-HistidineSigma AldrichH6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrateSigma Aldrich53370
MethanolFisher-ScientificA456-4 
Milli-QMillpore30035
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000
Orbitrap Exploris 480Thermo FisherBRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mLEppendorf (VWR)22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mLEppendorf (VWR)22431102
Proteome Discoverer software 2.4Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity KitBio-Rad1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity KitBio-Rad1633006
Sodium deoxycholate (SDC)Sigma AldrichD6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) Sigma AldrichL5777
SpeedVacLabconco7970010
Thermomixer REppendorf22670107
Trifluoracetic acid (TFA)Fisher-Scientific28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug)PromegaV5111
Tube Revolver RotatorThermo Fisher88881001
UltiMate 3000 RSLC nano systemThermo FisherULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0Thermo Fisher15568-025
Vortex Genie 2VWR102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade Fisher-ScientificLS118-4 

Ссылки

  1. Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
  2. Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design. Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).
  3. Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).
  4. Molden, R. Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development. MAbs. 13 (1), 1955811 (2021).
  5. Bee, J. S. Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).
  6. Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).
  7. Chiu, J., et al. Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations. Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).
  8. Gilgunn, S., et al. Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).
  9. Graf, T. Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).
  10. Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).
  11. Jones, M. 34;High-risk" host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).
  12. Li, X., et al. Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 37 (3), e3128 (2021).
  13. Zhang, S. Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases. Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).
  14. Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).
  15. Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).
  16. Gunawan, F. Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA. Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).
  17. Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment. Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).
  18. Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner. Analytical Biochemistry. 610, 113972 (2020).
  19. Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).
  20. Huang, L., et al. A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies. Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).
  21. Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies. Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).
  22. Kreimer, S. Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification. Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).
  23. Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis. MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).
  24. Nie, S. Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition. Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).
  25. Yang, F. Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products. Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).
  26. Zhang, Q. Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).
  27. Zhang, S., et al. Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).
  28. Zhang, J., He, J., Smith, K. J. Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).
  29. Uniprot1. . , (2023).
  30. Uniprot2. . , (2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE203LC MSProteoMiner

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены