エンリッチメントビーズと限定消化を組み合わせた宿主細胞タンパク質分析(英語)

要約

医薬品(DP)から宿主細胞タンパク質(HCP)を濃縮し、プロテオーム濃縮ビーズを使用してペプチドを検出するためのプロトコルが示されています。この分析法は、自社製のモノクローナル抗体(mAb)原薬(DS)を使用して実証されており、これは、性能の観点からさまざまな分析法を評価および比較するための十分に特性評価された標準物質です。

要約

宿主細胞タンパク質(HCP)は、少量であっても治療用タンパク質に悪影響を与える可能性のある不純物です。医薬品に関連する潜在的なリスクを評価するために、存在量の少ない医療従事者を特定する方法が開発されています。高感度の HCP 検出法を開発するための重要なアプローチは、液体クロマトグラフィー質量分析法(LC-MS)を利用して、分析前にモノクローナル抗体(mAb)を除去すると同時に HCP を濃縮することです。

このプロトコルは市販のプロテオーム濃縮のビードを使用して宿主のセル蛋白質を富ませるための詳しい指示を提供する。これらのビーズには、さまざまなタンパク質に特異的な親和性を持つヘキサペプチドリガンドの多様なライブラリが含まれています。このプロトコルには、ナノLC-MS/MSを使用した限定的な消化とその後のペプチド検出も組み込まれています。これらの技術を採用することで、存在量の少ない HCP を 7,000 倍以上濃縮することができ、検出限界は 0.002 ppm という驚異的な数値になります。重要なことに、このプロトコルでは、NIST mAb を使用して 850 の HCP を高い信頼性で検出できます。さらに、ユーザーフレンドリーになるように設計されており、その実装を支援するためのビデオデモンストレーションが含まれています。これらのステップを踏むことで、研究者は医療従事者を効果的に濃縮して検出し、医薬品のリスク評価の感度と精度を高めることができます。

概要

宿主細胞タンパク質(HCP)は、宿主生物の細胞培養から放出され、モノクローナル抗体(mAb)と共精製される不純物です1,2,3,4。微量レベルのHCPは、医薬品の品質に悪影響を与える可能性があります⁵、⁶、⁷、⁸、⁹、^10、11、¹²、^13、14、¹⁵、したがって、サブppmからppmレベルのHCPを検出するには^、高感度のHCP分析法が望まれています。

プロトコル

プロトコルで使用される略語は、 補足表1にリストされています。

1. 溶液および緩衝液の調製

注:すべての試薬の商品詳細は、 材料表に記載されています。

1. ガラスバイアル中の9 mLの脱イオン水に1 mLの1 M Tris-HCl、pH 8.0を加えて0.1 M Tris-HCl、pH 8.0の溶液を調製し、ボルテックスでよく混合します。4°Cで最長3ヶ月間保存してください。
2. 10 mg の SDC を 0.1 M Tris-HCl(pH 8.0)1 mL に溶解して、24 mM デオキシコール酸ナトリウム(SDC)を調製します。
3. 7 mg の SLS を 0.1 M Tris-HCl、pH 8.0 の 1 mL に溶解して、24 mM ラウロイルサルコシン酸ナトリウム(SLS)を調製します。
4. 24 mM SDC と 24 mM SLS を 1:1 (v/v) の比率で混合して溶出バッファーを調製します。
5. 20 μg のトリプシンに 400 μL の脱イオン水を加えて、50 ng/μL のトリプシン溶液を調製します。
6. 7.7 mg の DTT に 308 μL の 0.1 M Tris-HCl、pH 8.....

ディスカッション

市販のタンパク質濃縮ビーズには、容量の小さいものと容量の大きいものの2種類があります( 材料表を参照)。どちらのバージョンの濃縮ビーズにも、パッケージに 10 個のプレップが含まれています。メーカーの説明書では、小容量キットの各調製物を使用して、10 mgの総タンパク質を濃縮できることが示唆されています。ただし、DS からの宿主細胞タンパク質(HCP)濃縮の最適な?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3	Hamilton	91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm)	Thermo Fisher	164535
Acetonitrile	Fisher-Scientific	A955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade	Fisher-Scientific	LS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å)	CoAnn Technologies	HEB07503001718I
Centrifuge 5424	Eppendorf	5405000646
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher	A39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk	Agilent	12131020
GL-Tip GC	GL Sciences Inc	7820-11201
in-house mAb	Regeneron		concentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg)	Thermo Fisher	A39271
Isopropanol	Fisher-Scientific	149320025
L-Histidine	Sigma Aldrich	H6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrate	Sigma Aldrich	53370
Methanol	Fisher-Scientific	A456-4
Milli-Q	Millpore	30035
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000
Orbitrap Exploris 480	Thermo Fisher	BRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mL	Eppendorf (VWR)	22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mL	Eppendorf (VWR)	22431102
Proteome Discoverer software 2.4	Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit	Bio-Rad	1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit	Bio-Rad	1633006
Sodium deoxycholate (SDC)	Sigma Aldrich	D6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS)	Sigma Aldrich	L5777
SpeedVac	Labconco	7970010
Thermomixer R	Eppendorf	22670107
Trifluoracetic acid (TFA)	Fisher-Scientific	28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug)	Promega	V5111
Tube Revolver Rotator	Thermo Fisher	88881001
UltiMate 3000 RSLC nano system	Thermo Fisher	ULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0	Thermo Fisher	15568-025
Vortex Genie 2	VWR	102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade	Fisher-Scientific	LS118-4