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Résumé

Un protocole est présenté pour l’enrichissement des protéines de la cellule hôte (HCP) à partir de produits médicamenteux (DP) et la détection de peptides à l’aide de billes d’enrichissement du protéome. La méthode est démontrée à l’aide d’une substance médicamenteuse (DS) à base d’anticorps monoclonaux (mAb) fabriquée en interne, qui est un matériau de référence bien caractérisé pour évaluer et comparer différentes méthodes en termes de performance.

Résumé

Les protéines de la cellule hôte (HCP) sont des impuretés qui peuvent nuire aux protéines thérapeutiques, même en petites quantités. Afin d’évaluer les risques potentiels associés aux produits pharmaceutiques, des méthodes ont été mises au point pour identifier les PS de faible abondance. Une approche cruciale pour le développement d’une méthode sensible de détection des HCP consiste à enrichir les HCP tout en éliminant simultanément les anticorps monoclonaux (mAb) avant l’analyse, en utilisant la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse (LC-MS).

Ce protocole offre des instructions détaillées pour enrichir les protéines de la cellule hôte à l’aide de billes d’enrichissement du protéome disponibles dans le commerce. Ces billes contiennent une bibliothèque diversifiée de ligands hexapeptidiques ayant des affinités spécifiques pour différentes protéines. Le protocole intègre également une digestion limitée et une détection ultérieure des peptides à l’aide de nano LC-MS/MS. En employant ces techniques, les PS de faible abondance peuvent être enrichis plus de 7000 fois, ce qui se traduit par une limite de détection impressionnante aussi basse que 0,002 ppm. De manière significative, ce protocole permet la détection de 850 HCP avec un haut niveau de confiance à l’aide d’un anticorps monoclonal du NIST. De plus, il est conçu pour être convivial et comprend une démonstration vidéo pour aider à sa mise en œuvre. En suivant ces étapes, les chercheurs peuvent enrichir et détecter efficacement les PS, ce qui améliore la sensibilité et la précision de l’évaluation des risques pour les produits pharmaceutiques.

Introduction

Les protéines de la cellule hôte (HCP) sont des impuretés qui sont libérées par la culture cellulaire de l’organisme hôte et co-purifiées avec des anticorps monoclonaux (anticorps monoclonaux)1,2,3,4. Des traces de PS peuvent avoir un impact négatif sur la qualité du produit pharmaceutique 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 et, par conséquent, une méthode d’analyse sensible des PS est souhaitée pour détecter les PS à des niveaux inférieurs au ppm.

Des méthodes orthogonales peuvent être appliquées pour détecter les PS en faible abondance. Le test immuno-enzymatique (ELISA) est généralement utilisé pour quantifier l’ensemble des professionnels de la santé, et il peut également détecter et quantifier les professionnels de la santé individuels si les anticorps correspondants sont disponibles16. Cependant, la production d’anticorps spécifiques au HCP prend beaucoup de temps et de main-d’œuvre. En revanche, la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) peut fournir des informations complètes sur les HCP individuels dans les produits pharmaceutiques anticlonaux et est largement appliquée pour l’identification des HCP 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.

Plusieurs méthodes ont été mises au point pour détecter les professionnels de la santé avec LC-MS/MS, notamment la digestion limitée20, la filtration17, la délétion de la protéine A21, l’immunoprécipitation (IP) et l’enrichissement en protéoMiner (PM)18. La plupart des méthodes visent à réduire la quantité d’anticorps monoclonaux et à enrichir les professionnels de la santé avant l’analyse LC-MS/MS, diminuant ainsi la plage dynamique entre les peptides anticorps monoclonaux et les peptides de type HCP. Ce protocole présente une méthode d’enrichissement protéomique d’échantillons qui combine la technologie ProteoMiner et la digestion limitée (PMLD)28. Le principe d’enrichissement de ProteoMiner implique l’utilisation de billes d’enrichissement de protéome disponibles dans le commerce contenant une bibliothèque diversifiée de ligands peptidiques combinatoires. Ces ligands se lient spécifiquement aux protéines des anticorps-médicaments, ce qui permet d’éliminer les molécules en excès tout en concentrant les protéines de la cellule hôte (HCP) de faible abondance sur leurs ligands d’affinité respectifs. D’autre part, le principe de la digestion limitée implique l’utilisation d’une faible concentration de trypsine. Cette concentration est suffisante pour digérer les PS de faible abondance, mais pas assez pour digérer tous les produits médicamenteux à base d’anticorps. Cette approche permet la récupération et l’enrichissement des peptides HCP digérés à partir de la solution.

Par rapport aux méthodes de filtration, la technique PMLD n’est pas limitée par la taille des HCP détectés17. Les méthodes de délétion de la protéine A sont spécifiques à la détection des HCP associés aux anticorps21, tandis que l’immunoprécipitation est limitée aux HCP prédéfinis d’une lignée cellulaire particulière (telle que la lignée cellulaire de l’ovaire de hamster chinois (CHO)), où un anticorps anti-HCP a été généré4. En revanche, la PMLD peut être appliquée pour détecter les HCP à partir de n’importe quel module médicamenteux et des protéines de cellules hôtes co-purifiées avec des produits médicamenteux provenant de diverses lignées cellulaires. De plus, la PMLD présente une meilleure sensibilité par rapport aux méthodes mentionnées 17,18,20,21,24.

Cette approche permet d’enrichir la concentration de HCP de 7000 fois et d’abaisser la limite de détection à 0,002 ppm28. Le dispositif expérimental est illustré à la figure 1.

Protocole

Les abréviations utilisées dans le protocole sont énumérées dans le tableau supplémentaire 1.

1. Préparation des solutions et des tampons

REMARQUE : Les détails commerciaux de tous les réactifs sont répertoriés dans le tableau des matériaux.

  1. Préparer une solution de Tris-HCl à 0,1 M, pH 8,0 en ajoutant 1 mL de Tris-HCl à pH 8,0 dans 9 mL d’eau déminéralisée dans un flacon en verre, et bien mélanger par vortex. Conserver à 4 °C jusqu’à 3 mois.
  2. Préparer 24 mM de désoxycholate de sodium (SDC) en dissolvant 10 mg de SDC dans 1 mL de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0.
  3. Préparer 24 mM de lauroylsarcosinate de sodium (SLS) en dissolvant 7 mg de SLS dans 1 mL de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0.
  4. Préparer le tampon d’élution en mélangeant 24 mM de SDC et 24 mM de SLS dans un rapport de 1 :1 (v/v).
  5. Préparer 50 ng/μL de solution de trypsine en ajoutant 400 μL d’eau déminéralisée dans 20 μg de trypsine.
  6. Préparer 25 mg/mL de dithiothréitol (DTT) en ajoutant 308 μL de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, dans 7,7 mg de DTT.
  7. Préparer 0,25 M d’iodoacétamide (IAM) en ajoutant 1,2 mL de 0,1 M de Tris-HCl, pH 8,0, dans 56 mg d’IAM.
  8. Préparer 10 % d’AGT en ajoutant 1 mL d’acide trifluoroacétique (AGT) dans 9 mL d’eau déminéralisée. Tourbillonner pendant 4 s et faire tourner vers le bas. Conserver à 4 °C jusqu’à 3 mois.
  9. Préparer le tampon A en ajoutant 1 mL d’AGT à 10 % dans 99 mL d’eau déminéralisée.
  10. Préparer le tampon B en ajoutant 1 mL d’AGT à 10 % et 49 mL d’eau déminéralisée dans 50 mL d’acétonitrile (ACN).
  11. Préparez 10 mM de tampon d’histidine en ajoutant 37 mg de L-histidine et 54,8 mg de monochlorhydrate de L-histidine monohydraté dans 50 mL d’eau.

2. Préparation de solutions d’anticorps monoclonaux (mAb)

  1. Pour les produits médicamenteux dont les concentrations sont supérieures à 50 mg/mL, diluer 15 mg d’anticorps monoclonaux (mAb) (voir le tableau des matériaux) avec de l’eau déminéralisée dans un tube de microcentrifugation de 2 mL, ce qui donne un volume total de 300 μL et un pH final de ~6. Si nécessaire, ajustez le pH à l’aide d’acide acétique ou de Tris-HCl.
  2. Pour les produits pharmaceutiques dont les concentrations sont inférieures à 50 mg/mL, effectuer un échange de tampon en suivant les étapes 2.2.1 à 2.2.5.
    1. Transférer 20 mg de chaque échantillon dans un dispositif de filtration centrifuge 10k (voir le tableau des matériaux) et centrifuger à 14 000 x g pendant 25 min (à température ambiante, RT) jusqu’à ce qu’il reste environ 100 μL de volume.
    2. Ajouter 350 μL d’histidine à 10 mM (voir le tableau des matériaux), un tampon pH 6,0 dans le filtre, le vortex et la centrifugeuse à 14 000 x g pendant 25 min à RT. Répétez l’opération une fois.
    3. Retournez le filtre et placez-le dans le tube de prélèvement, puis centrifugez les échantillons à 1000 x g pendant 5 min à RT pour récupérer tout le volume dans le tube de prélèvement. Lavez le filtre avec 200 μL de tampon d’histidine 10 mM et pipetez de haut en bas pour récupérer les échantillons de protéines restants. Transférez l’ensemble de la solution dans le même tube de collecte, le même vortex et essorez-le.
    4. Mesurez la concentration de l’échantillon à l’aide de NanoDrop. Ajustez la concentration de chaque échantillon de protéine à 50 mg/mL en ajoutant le tampon d’histidine avant l’incubation avec des billes d’enrichissement.
    5. Transvaser 300 μL de l’échantillon dans un tube de microcentrifugation de 2 mL.

3. Préparation des billes d’enrichissement du protéome

  1. Retirez les capuchons supérieur et inférieur de chaque colonne d’essorage obtenue à partir de la trousse d’enrichissement en protéines du commerce (voir le tableau des matériaux). Ne jetez pas les bouchons, car ils seront utilisés plus tard.
  2. Prenez la colonne d’essorage et placez-la dans un tube de microcentrifugation de 2 ml sans bouchon. Centrifugez l’installation à température ambiante et 1 000 x g pendant 30 à 60 s à RT afin d’éliminer la solution de stockage. Éliminez le matériel collecté au cours de cette étape.
  3. Ajouter un tampon de lavage de 200 μL aux billes d’enrichissement disponibles dans le commerce (voir le tableau des matériaux) et pipeter plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Placez la colonne d’essorage dans un tube de microcentrifugation de 2 mL et centrifugez à 1 000 x g pendant 30 à 60 s à RT pour retirer le tampon. Jetez le matériel collecté.
    REMARQUE : Le tampon de lavage est inclus dans le kit d’enrichissement en protéines du commerce.
  4. Répétez les étapes 3.3 deux fois.
  5. Replacez le capuchon inférieur et ajoutez 200 μL d’eau, puis replacez le capuchon supérieur.

4. Enrichissement en protéines

  1. Pipeter la boue de haut en bas (à partir de l’étape 3.5) et transférer 40 μL de boue dans l’échantillon préparé à l’étape 2. Incuber et faire tourner le tube à température ambiante pendant 2 h.
  2. Fabriquez une pointe avec de la fritte (voir le tableau des matériaux) à l’aide de l’aiguille de 16 G pour obtenir la taille de fritte appropriée, puis insérez-la dans l’extrémité de la pointe de la pointe de 200 μL.
  3. Transférez l’échantillon avec les billes sur la pointe préparée à l’étape 4.2. Centrifuger l’embout avec un tube de microcentrifugation de 2 mL à 200 x g pendant 3 min à RT pour éliminer la solution.
  4. Lavez les billes en ajoutant 200 μL de tampon de lavage à l’embout et centrifugez l’embout avec un tube de microcentrifugation de 2 mL à 200 x g pendant 2 min à RT pour éliminer la solution de lavage. Répétez l’étape deux fois.
  5. Lavez les billes en ajoutant 200 μL d’eau à l’embout et centrifugez l’embout avec un tube de microcentrifugation de 2 mL à 200 x g pendant 2 min à RT pour éliminer l’eau.
  6. Éluer les protéines des billes en ajoutant 10 μL de tampon d’élution (étape 1.4) dans la pointe, et pipeter la boue dix fois dans la pointe pour s’assurer que les billes sont imbibées de tampon d’élution.
  7. Centrifuger l’embout à l’aide d’un nouveau tube de microcentrifugation de 0,5 mL à 200 x g pendant 30 s à RT pour recueillir l’éluant. Répétez deux fois les étapes 4.6 à 4.7 et combinez toutes les élutions dans un tube de microcentrifugation de 0,5 mL.
  8. Ajouter 1,5 μL de solution de trypsine (étape 1.5) dans l’éluant pour une digestion nocturne à 28 °C. Ajouter 1,5 μL de DTT à 25 mg/mL (étape 1.6) et chauffer l’échantillon à 90 °C pendant 20 min.
  9. Ajouter 1,5 μL de 0,25 M IAM (étape 1.7) et incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 20 min. Ajouter 3,5 μL 10 % TFA (étape 1.8), vortex pendant 2 min et s’assurer que le pH est à ~2-3.
  10. Centrifuger à 14 400 × g pendant 10 min à RT pour précipiter le SDC et le SLS. Récupérez le surnageant pour le dessalage.
  11. Effectuez le dessalage en suivant les étapes ci-dessous.
    1. Ajouter 50 μL de tampon B (étape 1.10) à la pointe de dessalage GC (voir le tableau des matériaux). Centrifuger l’embout à l’aide d’un support à 1000 x g pendant 3 min à RT. Jeter le matériau collecté.
    2. Ajouter 50 μL de tampon A (étape 1.9) à l’embout. Centrifuger l’embout à l’aide d’un support à 1000 x g pendant 3 min à RT. Jeter le matériau collecté.
    3. Ajouter l’échantillon acidifié à la pointe. Centrifuger l’embout à l’aide d’un support à 500 x g pendant 6 min à RT. Jeter le matériau collecté.
    4. Lavez l’embout en ajoutant 50 μL de tampon A à l’embout. Centrifuger l’embout avec le support à 500 x g pendant 3 min à RT. Jeter le matériau collecté. Répétez l’opération une fois.
    5. Éluer le peptide de l’embout en ajoutant 50 μL de tampon B à l’embout de dessalage GC. Centrifuger l’embout avec un nouveau tube à 500 x g pendant 3 min à RT. Récupérez le matériau. Répétez l’étape une fois et combinez l’éluant.
    6. Séchez l’éluant à l’aide d’un concentrateur sous vide (voir tableau des matériaux).
  12. Remettre l’éluant séché en suspension dans 30 μL de solution d’acide formique (AG) à 0,1 %.
  13. Mesurer l’UV des mélanges peptidiques à 214 nm à l’aide d’un spectrophotomètre (voir Tableau des matériaux). La concentration des mélanges peptidiques doit se situer entre 0,1 et 0,5 mg/mL.
  14. Transférez 10 μL de chaque échantillon digéré dans un flacon d’échantillon LC, puis injectez 1 μg de chaque échantillon digéré sur nano LC-MS/MS (voir le tableau des matériaux). Effectuez l’analyse en suivant l’étape 5. Conservez le reste des échantillons digérés dans un congélateur à -80 °C.

5. Analyse Nano LC-MS/MS

  1. Injecter le mélange peptidique dans un système nano-LC couplé à un spectromètre de masse. Charger les mélanges peptidiques (~1 μg) sur une colonne piège C18 avec le gradient indiqué dans le tableau 1A pour le dessalage, puis sur une colonne analytique C18 à 40 °C pour la séparation.
    NOTA : Le tampon mobile de la phase A était composé de 0,1 % d’AG dans de l’eau ultra-pure, et la phase mobile B était composée de 0,1 % d’AG dans 80 % d’ACN.
  2. Séparez les peptides et éluez avec le gradient fourni dans le tableau 1B avec un débit de 250 nL/min.
    REMARQUE : Le spectromètre de masse a fonctionné en mode dépendant des données (DDA) avec un temps de cycle de 3 s. Les ions ont subi une fragmentation par dissociation collisionnelle (HCD) à plus haute énergie avec une énergie de collision normalisée de 30 % pour chaque balayage MS complet. Les balayages ont été effectués à une résolution de 60 000, avec une cible de contrôle automatique du gain (AGC) de 3e6, un temps d’injection maximal de 20 ms et une plage m/z de 380 à 1600. Les événements MS/MS ont été menés à une résolution de 15 000, avec une cible AGC de 1e5, un temps d’injection maximal de 60 ms et une plage m/z de 200-2000. La durée d’exclusion a été fixée à 45 s. Les propriétés de la source d’ions sont fournies dans le tableau 1C, et les paramètres spécifiques de la spectrométrie de masse peuvent être trouvés dans le tableau 2A-F.

6. Analyse des données

  1. Effectuez une recherche dans les fichiers bruts de la spectrométrie de masse NISTmAb dans la base de données mus+musculus d’UniProt29. De plus, recherchez les fichiers bruts de spectrométrie de masse DS à base d’anticorps monoclonaux à base de données UniProt Cricetulus Griseus30.
    NOTE : Ces recherches ont été effectuées dans le logiciel Proteome Discoverer (voir la table des matériaux) à l’aide des moteurs de recherche Sequest HT et Mascot. Les bases de données utilisées étaient exemptes d’entrées redondantes.
  2. Pour les recherches par spectrométrie de masse, appliquez une tolérance de masse de 10 ppm et définissez la tolérance de masse des fragments sur 0,02 Da.
    NOTE : Les critères de recherche englobaient la carbamidométhylation statique des résidus de cystéine (+57,0214 Da) et la modification variable de l’oxydation (+15,9949 Da) sur les résidus de méthionine. De plus, une modification variable de la désamination (+0,984 Da) a été appliquée.
  3. Effectuez la recherche dans la base de données à l’aide de la digestion de la trypsine, en permettant un maximum de deux clivages manqués. Définissez les taux de fausses découvertes pour les protéines et les peptides à 0,01.
    REMARQUE : Pour identifier avec certitude les protéines de la cellule hôte (HCP), une exigence minimale d’au moins deux peptides uniques a été appliquée. Le tableau 3 fournit un résumé représentatif des professionnels de la santé identifiés associés aux anticorps monoclonaux du NIST analysés par le logiciel Proteome Discoverer.

Résultats

Ce protocole présentait un flux de travail de préparation d’échantillons, appelé enrichissement protéique couplé à une digestion limitée (PMLD), pour l’analyse des protéines de la cellule hôte (HCP) dans un échantillon d’anticorps monoclonaux (mAb). La figure 1 illustre la procédure étape par étape de la PMLD. Les chercheurs ont comparé les résultats de l’analyse du HCP à l’aide de la digestion directe (illustrée dans le panneau supérieur de la figure 2) et de la...

Discussion

Il existe deux versions de billes d’enrichissement en protéines disponibles dans le commerce : l’une avec une plus petite capacité et l’autre avec une plus grande capacité (voir le tableau des matériaux). Les deux versions des billes d’enrichissement contiennent dix préparations dans l’emballage. Les instructions du fabricant suggèrent que chaque préparation du kit de petite capacité peut être utilisée pour enrichir 10 mg de protéines totales. Cependant, pour une performance optimale...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Aucun.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3Hamilton91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm)Thermo Fisher164535
AcetonitrileFisher-ScientificA955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade Fisher-ScientificLS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter UnitMillipore SigmaUFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å)CoAnn TechnologiesHEB07503001718I
Centrifuge 5424Eppendorf5405000646
Dithiothreitol (DTT) Thermo FisherA39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pkAgilent12131020
GL-Tip GCGL Sciences Inc  7820-11201
in-house mAbRegeneronconcentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg)Thermo FisherA39271
IsopropanolFisher-Scientific149320025
L-HistidineSigma AldrichH6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrateSigma Aldrich53370
MethanolFisher-ScientificA456-4 
Milli-QMillpore30035
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000
Orbitrap Exploris 480Thermo FisherBRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mLEppendorf (VWR)22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mLEppendorf (VWR)22431102
Proteome Discoverer software 2.4Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity KitBio-Rad1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity KitBio-Rad1633006
Sodium deoxycholate (SDC)Sigma AldrichD6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) Sigma AldrichL5777
SpeedVacLabconco7970010
Thermomixer REppendorf22670107
Trifluoracetic acid (TFA)Fisher-Scientific28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug)PromegaV5111
Tube Revolver RotatorThermo Fisher88881001
UltiMate 3000 RSLC nano systemThermo FisherULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0Thermo Fisher15568-025
Vortex Genie 2VWR102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade Fisher-ScientificLS118-4 

Références

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