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Resumo

Um protocolo é apresentado para o enriquecimento de proteínas da célula hospedeira (HCPs) a partir de produtos farmacêuticos (PD) e detecção de peptídeos usando esferas de enriquecimento de proteoma. O método é demonstrado usando uma substância medicamentosa (MD) de anticorpos monoclonais (mAb) fabricada internamente, que é um material de referência bem caracterizado para avaliar e comparar diferentes métodos em termos de desempenho.

Resumo

As proteínas da célula hospedeira (HCPs) são impurezas que podem afetar adversamente as proteínas terapêuticas, mesmo em pequenas quantidades. Para avaliar os riscos potenciais associados aos medicamentos, métodos têm sido desenvolvidos para identificar PCH de baixa abundância. Uma abordagem crucial para o desenvolvimento de um método sensível de detecção de HCP envolve o enriquecimento de HCPs e, simultaneamente, a remoção de anticorpos monoclonais (mAbs) antes da análise, utilizando cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS).

Este protocolo oferece instruções detalhadas para o enriquecimento de proteínas da célula hospedeira usando esferas de enriquecimento de proteoma comercialmente disponíveis. Essas esferas contêm uma biblioteca diversificada de ligantes hexapeptídicos com afinidades específicas para diferentes proteínas. O protocolo também incorpora digestão limitada e subsequente detecção de peptídeos usando nano LC-MS/MS. Ao empregar essas técnicas, HCPs com baixa abundância podem ser enriquecidos mais de 7000 vezes, resultando em um limite de detecção impressionante tão baixo quanto 0,002 ppm. Significativamente, este protocolo permite a detecção de 850 HCPs com um alto nível de confiança usando um mAb do NIST. Além disso, ele foi projetado para ser fácil de usar e inclui uma demonstração em vídeo para ajudar na sua implementação. Ao seguir essas etapas, os pesquisadores podem efetivamente enriquecer e detectar PCHs, aumentando a sensibilidade e a precisão da avaliação de risco para produtos farmacêuticos.

Introdução

As proteínas da célula hospedeira (PCH) são impurezas liberadas da cultura celular do organismo hospedeiro e copurificadas com anticorpo monoclonal (mAb)1,2,3,4. Níveis traço de PID podem afetar negativamente a qualidade do medicamento 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 e, portanto, um método de análise sensível de PID é desejado para detectar PID em níveis sub-ppm a ppm.

Métodos ortogonais podem ser aplicados para detectar PCH em baixa abundância. O ensaio imunoenzimático (ELISA) é geralmente usado para quantificar HCPs globais, e também pode detectar e quantificar HCPs individuais se os anticorpos correspondentes estiverem disponíveis16. No entanto, a produção de anticorpos específicos para o HCP é demorada e trabalhosa. Em contraste, a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS) pode fornecer informações abrangentes sobre PCH individuais em medicamentos mAb e é amplamente aplicada para identificação de PCH 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.

Vários métodos têm sido desenvolvidos para detectar PCH com LC-MS/MS, incluindo digestão limitada20, filtração17, deleção da proteína A21, imunoprecipitação (IP) e enriquecimento com ProteoMiner (PM)18. A maioria dos métodos visa reduzir a quantidade de mAb e enriquecer HCPs antes da análise de LC-MS/MS, diminuindo assim a faixa dinâmica entre peptídeos mAb e peptídeos HCP. Este protocolo apresenta um método de enriquecimento proteômico de amostras que combina a tecnologia ProteoMiner e digestão limitada (PMLD)28. O princípio de enriquecimento do ProteoMiner envolve o uso de esferas de enriquecimento de proteoma comercialmente disponíveis contendo uma biblioteca diversificada de ligantes peptídicos combinatórios. Esses ligantes ligam-se especificamente a proteínas em produtos anticorpos-fármacos, permitindo a remoção de moléculas em excesso enquanto concentram proteínas de baixa abundância de células hospedeiras (HCPs) em seus respectivos ligantes de afinidade. Por outro lado, o princípio da digestão limitada envolve o uso de uma baixa concentração de tripsina. Esta concentração é suficiente para digerir HCPs de baixa abundância, mas não suficiente para digerir todos os produtos de drogas de anticorpos. Esta abordagem permite a recuperação e o enriquecimento de peptídeos HCP digeridos da solução.

Comparada aos métodos de filtração, a técnica de DLPM não é limitada pelo tamanho dos PID detectados17. Os métodos de deleção da proteína A são específicos para detectar HCPs associados a anticorpos21, enquanto a imunoprecipitação é restrita a HCPs predefinidos de uma linhagem celular particular (como a linhagem celular Chinese Hamster Ovary (CHO)), onde um anticorpo anti-HCP foi gerado4. Em contraste, PMLD pode ser aplicado para detectar HCPs de qualquer módulo de drogas e proteínas da célula hospedeira co-purificadas com produtos de drogas de várias linhagens celulares. Além disso, a DLPM apresenta melhor sensibilidade em relação aos métodos citados 17,18,20,21,24.

Essa abordagem pode enriquecer a concentração de HCP em 7000 vezes e reduzir o limite de detecção para 0,002 ppm28. O arranjo experimental está ilustrado na Figura 1.

Protocolo

As abreviaturas utilizadas no protocolo estão listadas na Tabela Suplementar 1.

1. Preparação de soluções e tampões

NOTA: Os detalhes comerciais de todos os reagentes estão listados na Tabela de Materiais.

  1. Preparar 0,1 M Tris-HCl, solução de pH 8,0 adicionando 1 mL de 1 M Tris-HCl, pH 8,0 em 9 mL de água deionizada em um frasco para injetáveis de vidro e misturar bem por vórtice. Conservar a 4 °C até 3 meses.
  2. Preparar 24 mM de desoxicolato de sódio (SDC) dissolvendo 10 mg de SDC em 1 mL de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0.
  3. Preparar 24 mM de lauroyl sarcosinato de sódio (SLS) dissolvendo 7 mg de SLS em 1 mL de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0.
  4. Prepare o buffer de eluição misturando 24 mM SDC e 24 mM SLS em uma proporção de 1:1 (v/v).
  5. Preparar 50 ng/μL de solução de tripsina adicionando 400 μL de água deionizada em 20 μg de tripsina.
  6. Preparar 25 mg/ml de ditiotreitol (TDT) adicionando 308 μL de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, em 7,7 mg de TDT.
  7. Preparar iodoacetamida (IAM) 0,25 M adicionando 1,2 ml de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, em 56 mg de IAM.
  8. Preparar 10% de TFA adicionando 1 mL de ácido trifluoroacético (TFA) em 9 mL de água deionizada. Vórtice por 4 s e gire para baixo. Conservar a 4 °C até 3 meses.
  9. Preparar o tampão A adicionando 1 mL de TFA a 10% em 99 mL de água deionizada.
  10. Preparar o tampão B adicionando 1 mL de TFA a 10% e 49 mL de água deionizada em 50 mL de acetonitrila (ACN).
  11. Preparar tampão de histidina 10 mM adicionando 37 mg de L-histidina e 54,8 mg de monocloridrato de L-histidina monohidratado em 50 ml de água.

2. Preparação de soluções de anticorpos monoclonais (mAb)

  1. Para medicamentos com concentrações acima de 50 mg/mL, diluir 15 mg do anticorpo monoclonal (mAb) (ver Tabela de Materiais) com água deionizada em um tubo de microcentrífuga de 2 mL, resultando em um volume total de 300 μL e pH final de ~6. Se necessário, ajuste o pH usando ácido acético ou Tris-HCl.
  2. Para medicamentos com concentrações inferiores a 50 mg/ml, efectuar a troca de tampão seguindo os passos 2.2.1 a 2.2.5.
    1. Transferir 20 mg de cada amostra para um dispositivo de filtro centrífugo de 10k (ver Tabela de Materiais) e centrifugar a 14.000 x g durante 25 minutos (à temperatura ambiente, RT) até restar aproximadamente 100 μL de volume.
    2. Adicionar 350 μL de histidina 10 mM (ver Tabela de Materiais), tampão pH 6,0 no filtro, vórtice e centrífuga a 14.000 x g por 25 minutos no RT. Repita uma vez.
    3. Inverter o filtro e colocá-lo no tubo de coleta de amostras e, em seguida, centrifugar as amostras a 1000 x g por 5 min no RT para recuperar todo o volume no tubo de coleta. Lavar o filtro com 200 μLof 10 mM tampão de histidina e pipetar para cima e para baixo para recuperar quaisquer amostras de proteína restantes. Transfira toda a solução para o mesmo tubo de coleta, vórtice e gire para baixo.
    4. Meça a concentração da amostra por NanoDrop. Ajustar a concentração de cada amostra de proteína para 50 mg/mL adicionando o tampão Histidina antes da incubação com esferas de enriquecimento.
    5. Transferir 300 μL da amostra para um tubo de microcentrífuga de 2 mL.

3. Preparação de esferas de enriquecimento de proteoma

  1. Remova a tampa superior e inferior de cada coluna de rotação obtida do kit comercial de enriquecimento de proteínas (ver Tabela de Materiais). Não descarte as tampas, pois elas serão usadas posteriormente.
  2. Pegue a coluna de spin e posicione-a em um tubo de microcentrífuga de 2 mL sem tampa. Centrifugar o setup à temperatura ambiente e 1.000 x g por 30-60 s em RT para eliminar a solução de armazenamento. Descarte o material coletado durante essa etapa.
  3. Adicione 200 μL de tampão de lavagem às esferas de enriquecimento disponíveis comercialmente (ver Tabela de Materiais) e pipete para cima e para baixo várias vezes. Coloque a coluna de spin em um tubo de microcentrífuga de 2 mL e centrífuga a 1.000 x g por 30-60 s em TR para remover o tampão. Descarte o material coletado.
    NOTA: O tampão de lavagem está incluído no kit comercial de enriquecimento de proteínas.
  4. Repita as etapas 3.3 duas vezes.
  5. Substitua a tampa inferior e adicione 200 μL de água e, em seguida, substitua a tampa superior.

4. Enriquecimento de proteínas

  1. Pipetar para cima e para baixo o chorume (a partir do passo 3.5) e transferir 40 μL de chorume para a amostra preparada no passo 2. Incubar e girar o tubo à temperatura ambiente durante 2 horas.
  2. Faça uma ponta com frita (ver Tabela de Materiais) usando a agulha de 16 G para obter o tamanho adequado da frita e, em seguida, insira-a na extremidade da ponta da ponta de 200 μL.
  3. Transfira a amostra com contas para a ponta preparada no passo 4.2. Centrifugar a ponta com 2 mL de tubo de microcentrífuga a 200 x g por 3 min na RT para remover a solução.
  4. Lave as contas adicionando 200 μL de tampão de lavagem à ponta e centrifugue a ponta com um tubo de microcentrífuga de 2 mL a 200 x g por 2 min em RT para remover a solução de lavagem. Repita a etapa duas vezes.
  5. Lave as contas adicionando 200 μL de água à ponta e centrifugar a ponta com um tubo de microcentrífuga de 2 mL a 200 x g por 2 min em RT para remover a água.
  6. Eluir proteínas de contas adicionando 10 μL de tampão de eluição (passo 1.4) na ponta e pipetar a pasta dez vezes na ponta para garantir que as contas estejam embebidas com tampão de eluição .
  7. Centrifugar a ponta com um novo tubo de microcentrífuga de 0,5 mL a 200 x g por 30 s no TR para coletar o eluente. Repita os passos 4.6-4.7 duas vezes e combine toda a eluição em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL.
  8. Adicionar 1,5 μL de solução de tripsina (passo 1.5) no eluente para digestão durante a noite a 28 °C. Adicionar 1,5 μL de 25 mg/ml de TDT (passo 1.6) e aquecer a amostra a 90 °C durante 20 minutos.
  9. Adicionar 1,5 μL de IAM 0,25 M (passo 1.7) e incubar à temperatura ambiente no escuro durante 20 min. Adicionar 3,5 μL de TFA a 10% (passo 1,8), vórtice durante 2 minutos e assegurar que o pH esteja em ~2-3.
  10. Centrifugar a 14.400 × g por 10 min em RT para precipitar SDC e SLS. Recolher o sobrenadante para dessalinização.
  11. Execute o dessalinização seguindo as etapas abaixo.
    1. Adicionar 50 μL de tampão B (passo 1.10) à ponta de dessalinização GC (ver Tabela de Materiais). Centrifugar a ponta com um suporte a 1000 x g por 3 min no RT. Descarte o material coletado.
    2. Adicionar 50 μL de tampão A (passo 1.9) à ponta. Centrifugar a ponta com um suporte a 1000 x g por 3 min no RT. Descarte o material coletado.
    3. Adicione a amostra acificada à ponta. Centrifugar a ponta com um suporte a 500 x g por 6 min no RT. Descarte o material coletado.
    4. Lave a ponta adicionando 50 μL de tampão A à ponta. Centrifugar a ponta com o suporte a 500 x g por 3 min no RT. Descarte o material coletado. Repita uma vez.
    5. Eluir o peptídeo da ponta adicionando 50 μL de tampão B à ponta de dessalinização GC. Centrifugar a ponta com um tubo novo a 500 x g por 3 min no RT. Recolher o material. Repita o passo uma vez e combine o eluente.
    6. Secar o eluente com um concentrador a vácuo (ver Tabela de Materiais).
  12. Ressuspender o eluente seco em 30 μL de solução de ácido fórmico (AG) a 0,1%.
  13. Medir o UV de misturas de peptídeos a 214 nm por um espectrofotômetro (ver Tabela de Materiais). A concentração das misturas peptídicas deve variar entre 0,1 e 0,5 mg/mL.
  14. Transfira 10 μL de cada amostra digerida para um frasco para injetáveis de amostra LC e, em seguida, injete 1 μg de cada amostra digerida em nano LC-MS/MS (ver Tabela de Materiais). Execute a análise seguindo a etapa 5. Conservar o resto das amostras digeridas num congelador a -80 °C.

5. Análise Nano LC-MS/MS

  1. Injetar a mistura peptídica em um sistema nano-LC acoplado a um espectrômetro de massa. Carregar as misturas de péptidos (~1 μg) numa coluna de armadilha C18 com o gradiente fornecido no quadro 1A para dessalinização e, em seguida, numa coluna analítica C18 a 40 °C para separação.
    NOTA: O tampão da fase A móvel consistiu de 0,1% de AG em água ultrapura, e a fase móvel B consistiu de 0,1% de AG em 80% de ACN.
  2. Separe os peptídeos e elua com o gradiente fornecido na Tabela 1B com fluxo de 250 nL/min.
    NOTA: O espectrômetro de massas foi operado em modo dependente de dados (DDA) com um tempo de ciclo de 3 s. Os íons sofreram fragmentação através da dissociação colisional de maior energia (HCD) com uma energia de colisão normalizada de 30% para cada exame completo de EM. Os exames foram realizados com resolução de 60.000, com meta de controle automático de ganho (AGC) de 3e6, tempo máximo de injeção de 20 ms e faixa m/z de 380-1600. Os eventos MS/MS foram conduzidos com resolução de 15.000, com meta de AGC de 1e5, tempo máximo de injeção de 60 ms e intervalo m/z de 200-2000. A duração da exclusão foi fixada em 45 s. As propriedades da fonte iônica são fornecidas na Tabela 1C, e os parâmetros específicos de espectrometria de massa podem ser encontrados na Tabela 2A-F.

6. Análise dos dados

  1. Realizar uma pesquisa dos arquivos brutos de espectrometria de massa NISTmAb no banco de dados UniProt mus+musculus29. Além disso, pesquise os arquivos brutos de espectrometria de massa mAb DS spiked-in da proteína recombinante no banco de dados UniProt Cricetulus Griseus30.
    NOTA: Essas buscas foram realizadas no software Proteome Discoverer (ver Tabela de Materiais) usando os mecanismos de busca Sequest HT e Mascot. As bases de dados utilizadas estavam livres de entradas redundantes.
  2. Para as pesquisas por espectrometria de massa, aplique uma tolerância de massa de 10 ppm e defina a tolerância de massa do fragmento para 0,02 Da.
    NOTA: Os critérios de busca abrangeram carbamidometilação estática de resíduos de cisteína (+57,0214 Da) e modificação variável da oxidação (+15,9949 Da) sobre resíduos de metionina. Adicionalmente, uma modificação da variável desaminação (+0,984 Da) foi aplicada.
  3. Realizar a busca no banco de dados usando digestão de tripsina, permitindo um máximo de duas clivagens perdidas. Defina as taxas de descoberta falsa para proteínas e peptídeos em 0,01.
    NOTA: Para identificar positivamente as proteínas da célula hospedeira (HCPs), um requisito mínimo de pelo menos dois peptídeos únicos foi aplicado. A Tabela 3 fornece o resumo representativo dos PIDs identificados associados ao MAB do NIST analisados pelo software Proteome Discoverer.

Resultados

Este protocolo apresentou um fluxo de trabalho de preparação de amostras, denominado enriquecimento proteico acoplado à digestão limitada (PMLD), para a análise de proteínas da célula hospedeira (HCPs) em uma amostra de anticorpo monoclonal (mAb). A Figura 1 ilustra o passo a passo do PMLD. Os pesquisadores compararam os resultados da análise de HCP usando digestão direta (mostrada no painel superior da Figura 2) e PMLD (mostrada no painel inferior da Figura 2

Discussão

Existem duas versões de esferas de enriquecimento de proteínas disponíveis comercialmente: uma com menor capacidade e outra com maior capacidade (ver Tabela de Materiais). Ambas as versões das contas de enriquecimento contêm dez preparações no pacote. As instruções do fabricante sugerem que cada preparação do kit de pequena capacidade pode ser usada para enriquecer 10 mg de proteína total. No entanto, para um ótimo desempenho do enriquecimento da proteína da célula hospedeira (HCP) a parti...

Divulgações

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Nenhum.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3Hamilton91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm)Thermo Fisher164535
AcetonitrileFisher-ScientificA955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade Fisher-ScientificLS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter UnitMillipore SigmaUFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å)CoAnn TechnologiesHEB07503001718I
Centrifuge 5424Eppendorf5405000646
Dithiothreitol (DTT) Thermo FisherA39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pkAgilent12131020
GL-Tip GCGL Sciences Inc  7820-11201
in-house mAbRegeneronconcentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg)Thermo FisherA39271
IsopropanolFisher-Scientific149320025
L-HistidineSigma AldrichH6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrateSigma Aldrich53370
MethanolFisher-ScientificA456-4 
Milli-QMillpore30035
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000
Orbitrap Exploris 480Thermo FisherBRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mLEppendorf (VWR)22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mLEppendorf (VWR)22431102
Proteome Discoverer software 2.4Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity KitBio-Rad1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity KitBio-Rad1633006
Sodium deoxycholate (SDC)Sigma AldrichD6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) Sigma AldrichL5777
SpeedVacLabconco7970010
Thermomixer REppendorf22670107
Trifluoracetic acid (TFA)Fisher-Scientific28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug)PromegaV5111
Tube Revolver RotatorThermo Fisher88881001
UltiMate 3000 RSLC nano systemThermo FisherULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0Thermo Fisher15568-025
Vortex Genie 2VWR102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade Fisher-ScientificLS118-4 

Referências

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