Sınırlı Sindirim ile Birleştirilmiş Zenginleştirme Boncukları Kullanılarak Konak Hücre Protein Analizi

Özet

İlaç ürünlerinden (DP) konak hücre proteinlerini (HCP'ler) zenginleştirmek ve proteom zenginleştirme boncukları kullanarak peptitleri tespit etmek için bir protokol sunulmaktadır. Yöntem, performans açısından farklı yöntemleri değerlendirmek ve karşılaştırmak için iyi karakterize edilmiş bir referans materyal olan, kurum içinde üretilmiş bir monoklonal antikor (mAb) ilaç maddesi (DS) kullanılarak gösterilmiştir.

Özet

Konak hücre proteinleri (HCP'ler), küçük miktarlarda bile terapötik proteinleri olumsuz yönde etkileyebilen safsızlıklardır. İlaç ürünleriyle ilişkili potansiyel riskleri değerlendirmek için, düşük bolluğa sahip HCP'leri belirlemeye yönelik yöntemler geliştirilmiştir. Hassas bir HCP tespit yöntemi geliştirmek için çok önemli bir yaklaşım, sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi (LC-MS) kullanılarak analizden önce monoklonal antikorları (mAb'ler) giderirken aynı anda HCP'leri zenginleştirmeyi içerir.

Bu protokol, ticari olarak temin edilebilen proteom zenginleştirme boncuklarını kullanarak konak hücre proteinlerini zenginleştirmek için ayrıntılı talimatlar sunar. Bu boncuklar, farklı proteinler için spesifik afinitelere sahip çeşitli hekzapeptid ligandları kütüphanesi içerir. Protokol ayrıca nano LC-MS/MS kullanılarak sınırlı sindirim ve müteakip peptit tespitini içerir. Bu teknikler kullanılarak, düşük bolluğa sahip HCP'ler 7000 kattan fazla zenginleştirilebilir ve bu da 0,002 ppm gibi etkileyici bir tespit limiti ile sonuçlanır. Önemli bir şekilde, bu protokol bir NIST mAb kullanarak 850 HCP'nin yüksek düzeyde güvenle tespit edilmesini sağlar. Ayrıca, kullanıcı dostu olacak şekilde tasarlanmıştır ve uygulanmasına yardımcı olacak bir video gösterimi içerir. Araştırmacılar bu adımları izleyerek, HCP'leri etkili bir şekilde zenginleştirebilir ve tespit edebilir, ilaç ürünleri için risk değerlendirmesinin hassasiyetini ve doğruluğunu artırabilir.

Giriş

Konak hücre proteinleri (HCP'ler), konakçı organizmanın hücre kültüründen salınan ve monoklonal antikor (mAb) ile birlikte saflaştırılan safsızlıklardır1,2,3,4. HCP'lerin eser seviyeleri, ilaç ürünü 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 kalitesini olumsuz etkileyebilir ve bu nedenle

Protokol

Protokolde kullanılan kısaltmalar Ek Tablo 1'de listelenmiştir.

1. Çözeltilerin ve tamponların hazırlanması

NOT: Tüm reaktiflerin ticari detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Bir cam şişede 9 mL deiyonize suya 1 mL 1 M Tris-HCl, pH 8.0 ekleyerek 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0 çözeltisi hazırlayın ve vorteksleyerek iyice karıştırın. 4 °C'de 3 aya kadar saklayın.
2. 10 mg SDC'yi 1 mL 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0 içinde çözerek 24 mM sodyum deoksikolat (SDC) hazırlayın.
3. 7 mg SLS'yi 1 mL 0.1 M Tris-HCl, pH 8.0 içinde çözerek 24 mM sodyum lauroil s....

Tartışmalar

Ticari olarak temin edilebilen protein zenginleştirme boncuklarının iki versiyonu vardır: biri daha küçük kapasiteli, diğeri daha büyük kapasiteli (bkz. Zenginleştirme boncuklarının her iki versiyonu da pakette on hazırlık içerir. Üreticinin talimatları, küçük kapasiteli kitten elde edilen her bir hazırlığın 10 mg toplam proteini zenginleştirmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Bununla birlikte, DS'den konak hücre proteini (HCP) zenginleştirmesinin optimum performa.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3	Hamilton	91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm)	Thermo Fisher	164535
Acetonitrile	Fisher-Scientific	A955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade	Fisher-Scientific	LS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å)	CoAnn Technologies	HEB07503001718I
Centrifuge 5424	Eppendorf	5405000646
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher	A39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk	Agilent	12131020
GL-Tip GC	GL Sciences Inc	7820-11201
in-house mAb	Regeneron		concentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg)	Thermo Fisher	A39271
Isopropanol	Fisher-Scientific	149320025
L-Histidine	Sigma Aldrich	H6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrate	Sigma Aldrich	53370
Methanol	Fisher-Scientific	A456-4
Milli-Q	Millpore	30035
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000
Orbitrap Exploris 480	Thermo Fisher	BRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mL	Eppendorf (VWR)	22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mL	Eppendorf (VWR)	22431102
Proteome Discoverer software 2.4	Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit	Bio-Rad	1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit	Bio-Rad	1633006
Sodium deoxycholate (SDC)	Sigma Aldrich	D6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS)	Sigma Aldrich	L5777
SpeedVac	Labconco	7970010
Thermomixer R	Eppendorf	22670107
Trifluoracetic acid (TFA)	Fisher-Scientific	28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug)	Promega	V5111
Tube Revolver Rotator	Thermo Fisher	88881001
UltiMate 3000 RSLC nano system	Thermo Fisher	ULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0	Thermo Fisher	15568-025
Vortex Genie 2	VWR	102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade	Fisher-Scientific	LS118-4