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In questo articolo

Riepilogo

Viene presentato un protocollo per l'arricchimento delle proteine della cellula ospite (HCP) da prodotti farmaceutici (DP) e la rilevazione di peptidi utilizzando perle di arricchimento del proteoma. Il metodo è dimostrato utilizzando una sostanza farmaceutica (DS) a base di anticorpi monoclonali (mAb) prodotta internamente, che è un materiale di riferimento ben caratterizzato per la valutazione e il confronto di diversi metodi in termini di prestazioni.

Abstract

Le proteine della cellula ospite (HCP) sono impurità che possono influire negativamente sulle proteine terapeutiche, anche in piccole quantità. Per valutare i potenziali rischi associati ai prodotti farmaceutici, sono stati sviluppati metodi per identificare gli operatori sanitari a bassa abbondanza. Un approccio cruciale per lo sviluppo di un metodo di rilevamento sensibile degli HCP prevede l'arricchimento degli HCP e la contemporanea rimozione degli anticorpi monoclonali (mAb) prima dell'analisi, utilizzando la cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS).

Questo protocollo offre istruzioni dettagliate per l'arricchimento delle proteine della cellula ospite utilizzando perle di arricchimento del proteoma disponibili in commercio. Queste perle contengono una libreria diversificata di ligandi esapeptidici con affinità specifiche per diverse proteine. Il protocollo incorpora anche una digestione limitata e il successivo rilevamento dei peptidi utilizzando nano LC-MS/MS. Impiegando queste tecniche, gli HCP con bassa abbondanza possono essere arricchiti di oltre 7000 volte, con un limite di rilevamento impressionante fino a 0,002 ppm. Significativamente, questo protocollo consente il rilevamento di 850 HCP con un alto livello di confidenza utilizzando un anticorpo monoclonale NIST. Inoltre, è progettato per essere facile da usare e include una dimostrazione video per assisterne l'implementazione. Seguendo questi passaggi, i ricercatori possono arricchire e rilevare efficacemente gli operatori sanitari, migliorando la sensibilità e l'accuratezza della valutazione del rischio per i prodotti farmaceutici.

Introduzione

Le proteine della cellula ospite (HCP) sono impurità che vengono rilasciate dalla coltura cellulare dell'organismo ospite e co-purificate con l'anticorpo monoclonale (mAb)1,2,3,4. I livelli di tracce di HCP possono avere un impatto negativo sulla qualità del prodotto farmaceutico 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 e, pertanto, è necessario un metodo di analisi HCP sensibile per rilevare gli HCP a livelli da sub-ppm a ppm.

I metodi ortogonali possono essere applicati per rilevare gli HCP in bassa abbondanza. Il test di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) è generalmente utilizzato per quantificare gli HCP complessivi e può anche rilevare e quantificare i singoli HCP se sono disponibili gli anticorpi corrispondenti16. Tuttavia, la produzione di anticorpi specifici per l'HCP richiede molto tempo e lavoro. Al contrario, la cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS) può fornire informazioni complete sui singoli HCP nei prodotti farmaceutici mAb ed è ampiamente applicata per l'identificazione degli HCP 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.

Sono stati sviluppati diversi metodi per rilevare gli HCP con LC-MS/MS, tra cui la digestione limitata20, la filtrazione 17, la delezione della proteina A21, l'immunoprecipitazione (IP) e l'arricchimento di ProteoMiner (PM)18. La maggior parte dei metodi mira a ridurre la quantità di anticorpi monoclonali e ad arricchire gli HCP prima dell'analisi LC-MS/MS, diminuendo così l'intervallo dinamico tra i peptidi degli anticorpi monoclonali e i peptidi HCP. Questo protocollo presenta un metodo di arricchimento del campione proteomico che combina la tecnologia ProteoMiner e la digestione limitata (PMLD)28. Il principio di arricchimento di ProteoMiner prevede l'utilizzo di perle di arricchimento del proteoma disponibili in commercio contenenti una libreria diversificata di ligandi peptidici combinatori. Questi ligandi si legano specificamente alle proteine sui prodotti anticorpali-farmacologici, consentendo la rimozione delle molecole in eccesso e concentrando le proteine delle cellule ospiti (HCP) a bassa abbondanza sui rispettivi ligandi di affinità. D'altra parte, il principio della digestione limitata prevede l'utilizzo di una bassa concentrazione di tripsina. Questa concentrazione è sufficiente per digerire gli HCP a bassa abbondanza, ma non sufficiente per digerire tutti i farmaci anticorpali. Questo approccio consente il recupero e l'arricchimento dei peptidi HCP digeriti dalla soluzione.

Rispetto ai metodi di filtrazione, la tecnica PMLD non è limitata dalle dimensioni degli HCP rilevati17. I metodi di delezione della proteina A sono specifici per rilevare gli HCP associati agli anticorpi21, mentre l'immunoprecipitazione è limitata agli HCP predefiniti di una particolare linea cellulare (come la linea cellulare dell'ovaio di criceto cinese (CHO)), in cui è stato generato un anticorpo anti-HCP4. Al contrario, la PMLD può essere applicata per rilevare gli HCP da qualsiasi modulo farmacologico e proteine della cellula ospite co-purificate con prodotti farmaceutici di varie linee cellulari. Inoltre, PMLD mostra una migliore sensibilità rispetto ai metodi menzionati 17,18,20,21,24.

Questo approccio può arricchire la concentrazione di HCP di 7000 volte e abbassare il limite di rilevamento a 0,002 ppm28. La configurazione sperimentale è illustrata nella Figura 1.

Protocollo

Le abbreviazioni utilizzate nel protocollo sono elencate nella tabella supplementare 1.

1. Preparazione di soluzioni e tamponi

NOTA: I dettagli commerciali di tutti i reagenti sono elencati nella Tabella dei materiali.

  1. Preparare una soluzione 0,1 M di Tris-HCl, pH 8,0 aggiungendo 1 mL di 1 M Tris-HCl, pH 8,0 in 9 mL di acqua deionizzata in un flaconcino di vetro e mescolare bene mediante vortex. Conservare a 4 °C per un massimo di 3 mesi.
  2. Preparare 24 mM di desossicolato di sodio (SDC) sciogliendo 10 mg di SDC in 1 mL di Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0.
  3. Preparare 24 mM di sodio lauroil sarcosinato (SLS) sciogliendo 7 mg di SLS in 1 mL di Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0.
  4. Preparare il tampone di eluizione mescolando 24 mM di SDC e 24 mM di SLS con un rapporto di 1:1 (v/v).
  5. Preparare 50 ng/μL di soluzione di tripsina aggiungendo 400 μL di acqua deionizzata a 20 μg di tripsina.
  6. Preparare 25 mg/mL di ditiotreitolo (DTT) aggiungendo 308 μL di Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, a 7,7 mg di DTT.
  7. Preparare iodoacetammide 0,25 M (IAM) aggiungendo 1,2 mL di Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, a 56 mg di IAM.
  8. Preparare il 10% di TFA aggiungendo 1 mL di acido trifluoroacetico (TFA) in 9 mL di acqua deionizzata. Vortice per 4 s e rotazione verso il basso. Conservare a 4 °C per un massimo di 3 mesi.
  9. Preparare il tampone A aggiungendo 1 mL di TFA al 10% in 99 mL di acqua deionizzata.
  10. Preparare il tampone B aggiungendo 1 mL di TFA al 10% e 49 mL di acqua deionizzata in 50 mL di acetonitrile (ACN).
  11. Preparare 10 mM di tampone di istidina aggiungendo 37 mg di L-istidina e 54,8 mg di L-istidina monocloridrato monoidrato in 50 ml di acqua.

2. Preparazione di soluzioni di anticorpi monoclonali (mAb)

  1. Per i prodotti farmaceutici con concentrazioni superiori a 50 mg/mL, diluire 15 mg dell'anticorpo monoclonale (mAb) (vedere la tabella dei materiali) con acqua deionizzata in una provetta da microcentrifuga da 2 mL, ottenendo un volume totale di 300 μL e un pH finale di ~6. Se necessario, regolare il pH utilizzando acido acetico o Tris-HCl.
  2. Per i prodotti farmaceutici con concentrazioni inferiori a 50 mg/mL, eseguire lo scambio di tamponi seguendo i passaggi da 2.2.1 a 2.2.5.
    1. Trasferire 20 mg di ciascun campione in un dispositivo di filtraggio centrifugo da 10k (vedere la tabella dei materiali) e centrifugare a 14.000 x g per 25 minuti (a temperatura ambiente, RT) fino a quando rimane un volume di circa 100 μL.
    2. Aggiungere 350 μL di istidina 10 mM (vedere la tabella dei materiali), tampone pH 6,0 nel filtro, nel vortice e centrifugare a 14.000 x g per 25 minuti a RT. Ripetere una volta.
    3. Capovolgere il filtro e posizionarlo nella provetta di raccolta del campione, quindi centrifugare i campioni a 1000 x g per 5 minuti a RT per recuperare l'intero volume nella provetta di raccolta. Lavare il filtro con 200 μL di tampone istidinico da 10 mM e pipettare su e giù per recuperare eventuali campioni proteici rimanenti. Trasferire l'intera soluzione nella stessa provetta di raccolta, vortice e centrifugazione.
    4. Misurare la concentrazione del campione con NanoDrop. Regolare la concentrazione di ciascun campione proteico a 50 mg/mL aggiungendo il tampone istidina prima dell'incubazione con microsfere di arricchimento.
    5. Trasferire 300 μL del campione in una provetta per microcentrifuga da 2 mL.

3. Preparazione di perle di arricchimento del proteoma

  1. Rimuovere il tappo superiore e inferiore da ciascuna colonna di centrifuga ottenuta dal kit di arricchimento proteico commerciale (vedere Tabella dei materiali). Non gettare i tappi, poiché verranno utilizzati in seguito.
  2. Prendere la colonna di centrifuga e posizionarla in una provetta per microcentrifuga da 2 mL senza tappo. Centrifugare l'impianto a temperatura ambiente e 1.000 x g per 30-60 s a RT per eliminare la soluzione di conservazione. Smaltire il materiale raccolto durante questa fase.
  3. Aggiungere 200 μL di tampone di lavaggio alle microsfere di arricchimento disponibili in commercio (vedere la tabella dei materiali) e pipettare più volte su e giù. Posizionare la colonna rotante in una provetta per microcentrifuga da 2 mL e centrifugare a 1.000 x g per 30-60 s a RT per rimuovere il tampone. Scartare il materiale raccolto.
    NOTA: Il tampone di lavaggio è incluso nel kit di arricchimento proteico commerciale.
  4. Ripetere due volte i passaggi 3.3.
  5. Riposizionare il tappo inferiore e aggiungere 200 μL di acqua, quindi riposizionare il tappo superiore.

4. Arricchimento proteico

  1. Pipettare su e giù per il liquame (dal punto 3.5) e trasferire 40 μL di liquame sul campione preparato nel passaggio 2. Incubare e ruotare la provetta a temperatura ambiente per 2 ore.
  2. Realizzare una punta con la fritta (vedere la tabella dei materiali) utilizzando l'ago da 16 G per ottenere la dimensione appropriata della fritta, quindi inserirla nell'estremità della punta della punta da 200 μL.
  3. Trasferire il campione con le perline sulla punta preparata al punto 4.2. Centrifugare la punta con una provetta per microcentrifuga da 2 mL a 200 x g per 3 minuti a RT per rimuovere la soluzione.
  4. Lavare le perle aggiungendo 200 μL di tampone di lavaggio al puntale e centrifugare il puntale con una provetta per microcentrifuga da 2 mL a 200 x g per 2 minuti a RT per rimuovere la soluzione di lavaggio. Ripeti il passaggio due volte.
  5. Lavare le perle aggiungendo 200 μL di acqua al puntale e centrifugare il puntale con una provetta da microcentrifuga da 2 mL a 200 x g per 2 minuti a RT per rimuovere l'acqua.
  6. Eluire le proteine dalle microsfere aggiungendo 10 μL di tampone di eluizione (passaggio 1.4) nel puntale e pipettare il liquame dieci volte nel puntale per assicurarsi che le microsfere siano imbevute di tampone di eluizione.
  7. Centrifugare il puntale con una nuova provetta per microcentrifuga da 0,5 mL a 200 x g per 30 s a RT per raccogliere l'eluente. Ripetere due volte i passaggi 4.6-4.7 e combinare tutta l'eluizione in una provetta per microcentrifuga da 0,5 mL.
  8. Aggiungere 1,5 μL di soluzione di tripsina (fase 1.5) nell'eluente per la digestione notturna a 28 °C. Aggiungere 1,5 μL di DTT da 25 mg/mL (fase 1.6) e riscaldare il campione a 90 °C per 20 minuti.
  9. Aggiungere 1,5 μL di IAM 0,25 M (passaggio 1,7) e incubare a temperatura ambiente al buio per 20 minuti. Aggiungere 3,5 μL di TFA al 10% (passaggio 1,8), vortice per 2 minuti e assicurarsi che il pH sia a ~2-3.
  10. Centrifugare a 14.400 × g per 10 minuti a RT per precipitare SDC e SLS. Raccogliere il surnatante per la dissalazione.
  11. Eseguire la dissalazione seguendo i passaggi seguenti.
    1. Aggiungere 50 μL di tampone B (passaggio 1.10) alla punta di desalinizzazione GC (vedere la tabella dei materiali). Centrifugare il puntale con un supporto a 1000 x g per 3 minuti a RT. Scartare il materiale raccolto.
    2. Aggiungere 50 μL di tampone A (passaggio 1.9) alla punta. Centrifugare il puntale con un supporto a 1000 x g per 3 minuti a RT. Scartare il materiale raccolto.
    3. Aggiungere il campione acidificato alla punta. Centrifugare il puntale con un supporto a 500 x g per 6 minuti a RT. Scartare il materiale raccolto.
    4. Lavare la punta aggiungendo 50 μL di tampone A alla punta. Centrifugare il puntale con il supporto a 500 x g per 3 minuti a RT. Scartare il materiale raccolto. Ripeti una volta.
    5. Eluire il peptide dalla punta aggiungendo 50 μL di tampone B alla punta di desalinizzazione GC. Centrifugare la punta con una nuova provetta a 500 x g per 3 minuti a RT. Raccogliere il materiale. Ripetere il passaggio una volta e combinare l'eluente.
    6. Asciugare l'eluente con un concentratore sottovuoto (vedi Tabella dei materiali).
  12. Risospendere l'eluente essiccato in 30 μL di soluzione di acido formico (FA) allo 0,1%.
  13. Misurare l'UV di miscele peptidiche a 214 nm con uno spettrofotometro (vedere Tabella dei materiali). La concentrazione delle miscele peptidiche deve essere compresa tra 0,1 e 0,5 mg/mL.
  14. Trasferire 10 μL di ciascun campione digerito in una fiala di campione LC, quindi iniettare 1 μg di ciascun campione digerito su nano LC-MS/MS (vedere la tabella dei materiali). Eseguire l'analisi seguendo il passaggio 5. Conservare il resto dei campioni digeriti in un congelatore a -80 °C.

5. Analisi Nano LC-MS/MS

  1. Iniettare la miscela peptidica in un sistema nano-LC accoppiato a uno spettrometro di massa. Caricare le miscele di peptidi (~1 μg) su una colonna trappola C18 con il gradiente fornito nella Tabella 1A per la desalinizzazione e quindi su una colonna analitica C18 a 40 °C per la separazione.
    NOTA: Il tampone di fase mobile A era costituito dallo 0,1% di FA in acqua ultrapura e la fase mobile B consisteva dallo 0,1% di FA nell'80% di ACN.
  2. Separare i peptidi ed eluire con il gradiente indicato nella Tabella 1B con una portata di 250 nL/min.
    NOTA: Lo spettrometro di massa è stato utilizzato in modalità dipendente dai dati (DDA) con un tempo di ciclo di 3 s. Gli ioni hanno subito una frammentazione attraverso la dissociazione collisionale ad alta energia (HCD) con un'energia di collisione normalizzata del 30% per ogni scansione MS completa. Le scansioni sono state eseguite a una risoluzione di 60.000, con un target di controllo automatico del guadagno (AGC) di 3e6, un tempo di iniezione massimo di 20 ms e un intervallo m/z di 380-1600. Gli eventi MS/MS sono stati condotti con una risoluzione di 15.000, con un target AGC di 1e5, un tempo di iniezione massimo di 60 ms e un intervallo m/z di 200-2000. La durata dell'esclusione è stata impostata su 45 s. Le proprietà della sorgente ionica sono fornite nella Tabella 1C e i parametri specifici della spettrometria di massa sono riportati nella Tabella 2A-F.

6. Analisi dei dati

  1. Eseguire una ricerca dei file grezzi della spettrometria di massa NISTmAb rispetto al database UniProt mus+musculus29. Inoltre, cercare i file grezzi di spettrometria di massa mAb DS con proteina spiked della proteina ricombinante rispetto al database UniProt Cricetulus Griseus30.
    NOTA: Queste ricerche sono state condotte nel software Proteome Discoverer (vedi Tabella dei materiali) utilizzando i motori di ricerca Sequest HT e Mascot. Le banche dati utilizzate erano prive di voci ridondanti.
  2. Per le ricerche di spettrometria di massa, applicare una tolleranza di massa di 10 ppm e impostare la tolleranza di massa del frammento su 0,02 Da.
    NOTA: I criteri di ricerca comprendevano la carbamidometilazione statica dei residui di cisteina (+57.0214 Da) e la modificazione variabile dell'ossidazione (+15.9949 Da) sui residui di metionina. Inoltre, è stata applicata una modifica variabile della deaminazione (+0,984 Da).
  3. Eseguire la ricerca nel database utilizzando la digestione della tripsina, consentendo un massimo di due scissioni mancate. Impostare i tassi di falsa scoperta sia per le proteine che per i peptidi a 0,01.
    NOTA: Per identificare positivamente le proteine della cellula ospite (HCP), è stato applicato un requisito minimo di almeno due peptidi unici. La Tabella 3 fornisce il riepilogo rappresentativo degli HCP identificati associati agli anticorpi monoclonali NIST analizzati dal software Proteome Discoverer.

Risultati

Questo protocollo ha presentato un flusso di lavoro per la preparazione del campione, denominato arricchimento proteico accoppiato con digestione limitata (PMLD), per l'analisi delle proteine della cellula ospite (HCP) in un campione di anticorpi monoclonali (mAb). La Figura 1 illustra la procedura passo-passo di PMLD. I ricercatori hanno confrontato i risultati dell'analisi HCP utilizzando la digestione diretta (mostrata nel pannello superiore della Figura 2) e PMLD (mostrata nel pannello i...

Discussione

Esistono due versioni di perle di arricchimento proteico disponibili in commercio: una con una capacità inferiore e l'altra con una capacità maggiore (vedi Tabella dei materiali). Entrambe le versioni delle perle di arricchimento contengono dieci preparazioni nella confezione. Le istruzioni del produttore suggeriscono che ogni preparazione del kit di piccola capacità può essere utilizzata per arricchire 10 mg di proteine totali. Tuttavia, per prestazioni ottimali dell'arricchimento di proteine della ...

Divulgazioni

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Riconoscimenti

Nessuno.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3Hamilton91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm)Thermo Fisher164535
AcetonitrileFisher-ScientificA955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade Fisher-ScientificLS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter UnitMillipore SigmaUFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å)CoAnn TechnologiesHEB07503001718I
Centrifuge 5424Eppendorf5405000646
Dithiothreitol (DTT) Thermo FisherA39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pkAgilent12131020
GL-Tip GCGL Sciences Inc  7820-11201
in-house mAbRegeneronconcentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg)Thermo FisherA39271
IsopropanolFisher-Scientific149320025
L-HistidineSigma AldrichH6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrateSigma Aldrich53370
MethanolFisher-ScientificA456-4 
Milli-QMillpore30035
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000
Orbitrap Exploris 480Thermo FisherBRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mLEppendorf (VWR)22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mLEppendorf (VWR)22431102
Proteome Discoverer software 2.4Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity KitBio-Rad1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity KitBio-Rad1633006
Sodium deoxycholate (SDC)Sigma AldrichD6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) Sigma AldrichL5777
SpeedVacLabconco7970010
Thermomixer REppendorf22670107
Trifluoracetic acid (TFA)Fisher-Scientific28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug)PromegaV5111
Tube Revolver RotatorThermo Fisher88881001
UltiMate 3000 RSLC nano systemThermo FisherULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0Thermo Fisher15568-025
Vortex Genie 2VWR102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade Fisher-ScientificLS118-4 

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