使用富集微球与有限消化相结合的宿主细胞蛋白分析

摘要

提出了一种从药物产品（DP）中富集宿主细胞蛋白（HCP）和使用蛋白质组富集珠检测肽的方案。该方法使用内部制造的单克隆抗体 （mAb） 原料药 （DS） 进行演示，该物质是一种表征良好的参考物质，用于评估和比较不同方法的性能。

摘要

宿主细胞蛋白 （HCP） 是会对治疗性蛋白质产生不利影响的杂质，即使是少量的。为了评估与药品相关的潜在风险，已经开发了识别低丰度HCP的方法。开发灵敏的HCP检测方法的一个关键方法是利用液相色谱-质谱联用（LC-MS）在分析前富集HCP，同时去除单克隆抗体（mAb）。

该协议提供了使用市售蛋白质组富集珠富集宿主细胞蛋白的详细说明。这些磁珠包含对不同蛋白质具有特异性亲和力的多种六肽配体库。该方案还包括使用纳米LC-MS/MS进行有限的酶解和随后的肽检测。通过采用这些技术，低丰度的HCP可以富集超过7000倍，从而获得低至0.002 ppm的令人印象深刻的检测限。值得注意的是，该协议能够使用 NIST mAb 以高置信度检测 850 个 HCP。此外，它被设计为用户友好型，并包括一个视频演示，以协助其实施。通过遵循这些步骤，研究人员可以有效地富集和检测HCP，提高药品风险评估的灵敏度和准确性。

引言

宿主细胞蛋白 （HCP） 是从宿主生物体的细胞培养物中释放出来并与单克隆抗体 （mAb^{） 共}纯化的杂质1,2,3,4。痕量HCPs会^{对药品的质量}产生负面影响5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15，因此^，需要一种灵敏的HCP分析方法来检测亚ppm至ppm水平的HCP。

正交方....

研究方案

协议中使用的缩写列于 补充表1中。

1. 溶液和缓冲液的制备

注：所有试剂的商业细节均列在 材料表中。

1. 通过将 1 mL 的 1 M Tris-HCl（pH 8.0）加入玻璃小瓶中的 9 mL 去离子水中，制备 0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）溶液，并通过涡旋充分混合。在4°C下储存长达3个月。
2. 通过将 10 mg SDC 溶解在 1 mL 的 0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）中来制备 24 mM 脱氧胆酸钠 （SDC）。
3. 通过将 7 mg SLS 溶解在 1 mL 的 0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）中，制备 24 mM 月桂酰肌氨酸钠 （SLS）。
4. 通过以 1：1 （v/v） 的比例混合 24 mM SDC 和 24 mM SLS 来制备洗脱缓冲液。
5. 通过将 400 μL 去离子水加入 20 μg 胰蛋白酶中来制备 50 ng/μL 胰蛋白酶溶液。
6. 通过将 308 μL 的 0.1 M Tris-HCl（pH 8.0）加入 7.7 mg DTT 中，制备 25 mg/mL 二硫苏糖醇 （DTT）。
7. 通过将 1.2 mL 的 0.1 M Tris....

讨论

市售的蛋白质富集微球有两种版本：一种容量较小，另一种容量较大（参见 材料表）。两种版本的富集微球在包装中都含有十种制备物。制造商的说明表明，小容量试剂盒中的每个制备都可用于富集 10 mg 总蛋白。然而，为了实现 DS 宿主细胞蛋白 （HCP） 富集的最佳性能，每次制备都适合 5 个 DS 样品。因此，每个试剂盒可用于从 50 个样品中富集 HCP。对于大容量试剂盒的每种制备方法.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3	Hamilton	91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm)	Thermo Fisher	164535
Acetonitrile	Fisher-Scientific	A955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade	Fisher-Scientific	LS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å)	CoAnn Technologies	HEB07503001718I
Centrifuge 5424	Eppendorf	5405000646
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher	A39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk	Agilent	12131020
GL-Tip GC	GL Sciences Inc	7820-11201
in-house mAb	Regeneron		concentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg)	Thermo Fisher	A39271
Isopropanol	Fisher-Scientific	149320025
L-Histidine	Sigma Aldrich	H6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrate	Sigma Aldrich	53370
Methanol	Fisher-Scientific	A456-4
Milli-Q	Millpore	30035
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000
Orbitrap Exploris 480	Thermo Fisher	BRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mL	Eppendorf (VWR)	22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mL	Eppendorf (VWR)	22431102
Proteome Discoverer software 2.4	Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit	Bio-Rad	1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit	Bio-Rad	1633006
Sodium deoxycholate (SDC)	Sigma Aldrich	D6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS)	Sigma Aldrich	L5777
SpeedVac	Labconco	7970010
Thermomixer R	Eppendorf	22670107
Trifluoracetic acid (TFA)	Fisher-Scientific	28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug)	Promega	V5111
Tube Revolver Rotator	Thermo Fisher	88881001
UltiMate 3000 RSLC nano system	Thermo Fisher	ULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0	Thermo Fisher	15568-025
Vortex Genie 2	VWR	102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade	Fisher-Scientific	LS118-4