Análisis de proteínas de la célula huésped mediante perlas de enriquecimiento junto con digestión limitada

Resumen

Se presenta un protocolo para enriquecer proteínas de células huésped (HCP) a partir de productos farmacológicos (DP) y detectar péptidos mediante perlas de enriquecimiento de proteomas. El método se demuestra utilizando una sustancia farmacológica (DS) de anticuerpos monoclonales (mAb) de fabricación propia, que es un material de referencia bien caracterizado para evaluar y comparar diferentes métodos en términos de rendimiento.

Resumen

Las proteínas de la célula huésped (HCP) son impurezas que pueden afectar negativamente a las proteínas terapéuticas, incluso en pequeñas cantidades. Para evaluar los riesgos potenciales asociados con los productos farmacéuticos, se han desarrollado métodos para identificar a los profesionales de la salud de baja abundancia. Un enfoque crucial para el desarrollo de un método sensible de detección de HCP consiste en enriquecer a los HCP y, al mismo tiempo, eliminar los anticuerpos monoclonales (mAb) antes del análisis, utilizando cromatografía líquida y espectrometría de masas (LC-MS).

Este protocolo ofrece instrucciones detalladas para enriquecer las proteínas de la célula huésped utilizando perlas de enriquecimiento de proteoma disponibles en el mercado. Estas perlas contienen una biblioteca diversa de ligandos hexapéptidos con afinidades específicas por diferentes proteínas. El protocolo también incorpora la digestión limitada y la posterior detección de péptidos mediante nano LC-MS/MS. Al emplear estas técnicas, los HCP con baja abundancia se pueden enriquecer más de 7000 veces, lo que resulta en un impresionante límite de detección tan bajo como 0.002 ppm. Cabe destacar que este protocolo permite la detección de 850 profesionales de la salud con un alto nivel de confianza utilizando un mAb del NIST. Además, está diseñado para ser fácil de usar e incluye una demostración en video para ayudar con su implementación. Al seguir estos pasos, los investigadores pueden enriquecer y detectar eficazmente a los profesionales de la salud, mejorando la sensibilidad y la precisión de la evaluación de riesgos de los productos farmacéuticos.

Introducción

Las proteínas de la célula huésped (HCP) son impurezas que se liberan del cultivo celular del organismo huésped y se copurifican con anticuerpos monoclonales (mAb)1,2,3,4. Los niveles traza de HCP pueden afectar negativamente la calidad del producto farmacéutico 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 y, por lo tanto

Protocolo

Las abreviaturas utilizadas en el protocolo se enumeran en la Tabla Suplementaria 1.

1. Preparación de soluciones y tampones

NOTA: Los detalles comerciales de todos los reactivos se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Prepare una solución de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0 añadiendo 1 ml de Tris-HCl 1 M, pH 8,0 en 9 ml de agua desionizada en un vial de vidrio y mezcle bien mediante vórtice. Conservar a 4 °C durante un máximo de 3 meses.
2. Preparar 24 mM de desoxicolato de sodio (SDC) disolviendo 10 mg de SDC en 1 mL de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0.
3. P....

Discusión

Hay dos versiones de perlas de enriquecimiento de proteínas disponibles comercialmente: una con una capacidad más pequeña y la otra con una capacidad más grande (ver Tabla de materiales). Ambas versiones de las perlas de enriquecimiento contienen diez preparaciones en el paquete. Las instrucciones del fabricante sugieren que cada preparación del kit de pequeña capacidad se puede usar para enriquecer 10 mg de proteína total. Sin embargo, para un rendimiento óptimo del enriquecimiento de proteínas.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3	Hamilton	91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm)	Thermo Fisher	164535
Acetonitrile	Fisher-Scientific	A955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade	Fisher-Scientific	LS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit	Millipore Sigma	UFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å)	CoAnn Technologies	HEB07503001718I
Centrifuge 5424	Eppendorf	5405000646
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher	A39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pk	Agilent	12131020
GL-Tip GC	GL Sciences Inc	7820-11201
in-house mAb	Regeneron		concentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg)	Thermo Fisher	A39271
Isopropanol	Fisher-Scientific	149320025
L-Histidine	Sigma Aldrich	H6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrate	Sigma Aldrich	53370
Methanol	Fisher-Scientific	A456-4
Milli-Q	Millpore	30035
NanoDrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000
Orbitrap Exploris 480	Thermo Fisher	BRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mL	Eppendorf (VWR)	22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mL	Eppendorf (VWR)	22431102
Proteome Discoverer software 2.4	Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity Kit	Bio-Rad	1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity Kit	Bio-Rad	1633006
Sodium deoxycholate (SDC)	Sigma Aldrich	D6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS)	Sigma Aldrich	L5777
SpeedVac	Labconco	7970010
Thermomixer R	Eppendorf	22670107
Trifluoracetic acid (TFA)	Fisher-Scientific	28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug)	Promega	V5111
Tube Revolver Rotator	Thermo Fisher	88881001
UltiMate 3000 RSLC nano system	Thermo Fisher	ULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0	Thermo Fisher	15568-025
Vortex Genie 2	VWR	102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade	Fisher-Scientific	LS118-4