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  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Se presenta un protocolo para enriquecer proteínas de células huésped (HCP) a partir de productos farmacológicos (DP) y detectar péptidos mediante perlas de enriquecimiento de proteomas. El método se demuestra utilizando una sustancia farmacológica (DS) de anticuerpos monoclonales (mAb) de fabricación propia, que es un material de referencia bien caracterizado para evaluar y comparar diferentes métodos en términos de rendimiento.

Resumen

Las proteínas de la célula huésped (HCP) son impurezas que pueden afectar negativamente a las proteínas terapéuticas, incluso en pequeñas cantidades. Para evaluar los riesgos potenciales asociados con los productos farmacéuticos, se han desarrollado métodos para identificar a los profesionales de la salud de baja abundancia. Un enfoque crucial para el desarrollo de un método sensible de detección de HCP consiste en enriquecer a los HCP y, al mismo tiempo, eliminar los anticuerpos monoclonales (mAb) antes del análisis, utilizando cromatografía líquida y espectrometría de masas (LC-MS).

Este protocolo ofrece instrucciones detalladas para enriquecer las proteínas de la célula huésped utilizando perlas de enriquecimiento de proteoma disponibles en el mercado. Estas perlas contienen una biblioteca diversa de ligandos hexapéptidos con afinidades específicas por diferentes proteínas. El protocolo también incorpora la digestión limitada y la posterior detección de péptidos mediante nano LC-MS/MS. Al emplear estas técnicas, los HCP con baja abundancia se pueden enriquecer más de 7000 veces, lo que resulta en un impresionante límite de detección tan bajo como 0.002 ppm. Cabe destacar que este protocolo permite la detección de 850 profesionales de la salud con un alto nivel de confianza utilizando un mAb del NIST. Además, está diseñado para ser fácil de usar e incluye una demostración en video para ayudar con su implementación. Al seguir estos pasos, los investigadores pueden enriquecer y detectar eficazmente a los profesionales de la salud, mejorando la sensibilidad y la precisión de la evaluación de riesgos de los productos farmacéuticos.

Introducción

Las proteínas de la célula huésped (HCP) son impurezas que se liberan del cultivo celular del organismo huésped y se copurifican con anticuerpos monoclonales (mAb)1,2,3,4. Los niveles traza de HCP pueden afectar negativamente la calidad del producto farmacéutico 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 y, por lo tanto, se desea un método de análisis de HCP sensible para detectar HCP en niveles inferiores a ppm.

Se pueden aplicar métodos ortogonales para detectar HCP en baja abundancia. El ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) se utiliza generalmente para cuantificar los HCP generales, y también puede detectar y cuantificar los HCP individuales si se dispone de los anticuerpos correspondientes16. Sin embargo, la producción de anticuerpos específicos para el HCP requiere mucho tiempo y mano de obra. Por el contrario, la cromatografía líquida junto con la espectrometría de masas (LC-MS) puede proporcionar información completa sobre los HCP individuales en los medicamentos mAb y se aplica ampliamente para la identificación de HCP 4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21,22,23,24,25,26,27.

Se han desarrollado varios métodos para detectar HCP con LC-MS/MS, incluyendo la digestión limitada20, la filtración17, la deleción de la proteína A21, la inmunoprecipitación (IP) y el enriquecimiento de ProteoMiner (PM)18. La mayoría de los métodos tienen como objetivo reducir la cantidad de anticuerpos monoclonales y enriquecer los profesionales de la salud antes del análisis de LC-MS/MS, disminuyendo así el rango dinámico entre los péptidos de anticuerpos monoclonales y los péptidos de los profesionales sanitarios. Este protocolo presenta un método de enriquecimiento proteómico de muestras que combina la tecnología ProteoMiner y la digestión limitada (PMLD)28. El principio de enriquecimiento de ProteoMiner implica el uso de perlas de enriquecimiento de proteoma disponibles comercialmente que contienen una biblioteca diversa de ligandos peptídicos combinatorios. Estos ligandos se unen específicamente a las proteínas de los productos farmacológicos de anticuerpos, lo que permite la eliminación del exceso de moléculas mientras concentran las proteínas de la célula huésped (HCP) de baja abundancia en sus respectivos ligandos de afinidad. Por otro lado, el principio de digestión limitada implica el uso de una baja concentración de tripsina. Esta concentración es suficiente para digerir los profesionales de la salud de baja abundancia, pero no es suficiente para digerir todos los medicamentos de anticuerpos. Este enfoque permite la recuperación y el enriquecimiento de los péptidos HCP digeridos a partir de la solución.

En comparación con los métodos de filtración, la técnica PMLD no está limitada por el tamaño de los PS detectados17. Los métodos de deleción de la proteína A son específicos para detectar HCP asociados con anticuerpos21, mientras que la inmunoprecipitación se restringe a HCP predefinidos de una línea celular particular (como la línea celular de ovario de hámster chino (CHO)), donde se generó un anticuerpo anti-HCP4. Por el contrario, la PMLD se puede aplicar para detectar HCP de cualquier módulo farmacológico y proteínas de la célula huésped copurificadas con productos farmacológicos de varias líneas celulares. Además, la PMLD presenta una mejor sensibilidad en comparación con los métodos mencionados 17,18,20,21,24.

Este enfoque puede enriquecer la concentración de HCP en 7000 veces y reducir el límite de detección a 0,002 ppm28. La configuración experimental se ilustra en la Figura 1.

Protocolo

Las abreviaturas utilizadas en el protocolo se enumeran en la Tabla Suplementaria 1.

1. Preparación de soluciones y tampones

NOTA: Los detalles comerciales de todos los reactivos se enumeran en la Tabla de Materiales.

  1. Prepare una solución de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0 añadiendo 1 ml de Tris-HCl 1 M, pH 8,0 en 9 ml de agua desionizada en un vial de vidrio y mezcle bien mediante vórtice. Conservar a 4 °C durante un máximo de 3 meses.
  2. Preparar 24 mM de desoxicolato de sodio (SDC) disolviendo 10 mg de SDC en 1 mL de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0.
  3. Prepare 24 mM de laurelil sarcosinato de sodio (SLS) disolviendo 7 mg de SLS en 1 mL de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0.
  4. Prepare el tampón de elución mezclando 24 mM SDC y 24 mM SLS en una proporción de 1:1 (v/v).
  5. Prepare 50 ng/μL de solución de tripsina añadiendo 400 μL de agua desionizada en 20 μg de tripsina.
  6. Prepare 25 mg/ml de ditiotreitol (DTT) añadiendo 308 μL de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, en 7,7 mg de DTT.
  7. Prepare yodoacetamida (IAM) 0,25 M añadiendo 1,2 ml de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, en 56 mg de IAM.
  8. Prepare AGT al 10% agregando 1 mL de ácido trifluoroacético (TFA) en 9 mL de agua desionizada. Vórtice durante 4 s y gire hacia abajo. Conservar a 4 °C durante un máximo de 3 meses.
  9. Prepare el tampón A agregando 1 ml de TFA al 10% en 99 ml de agua desionizada.
  10. Prepare el tampón B agregando 1 ml de AGT al 10% y 49 ml de agua desionizada en 50 ml de acetonitrilo (ACN).
  11. Prepare 10 mM de tampón de histidina añadiendo 37 mg de L-histidina y 54,8 mg de monoclorhidrato de L-histidina monohidrato en 50 mL de agua.

2. Preparación de soluciones de anticuerpos monoclonales (mAb)

  1. Para productos farmacéuticos con concentraciones superiores a 50 mg/ml, diluir 15 mg del anticuerpo monoclonal (mAb) (ver tabla de materiales) con agua desionizada en un tubo de microcentrífuga de 2 ml, lo que da como resultado un volumen total de 300 μl y un pH final de ~6. Si es necesario, ajuste el pH con ácido acético o Tris-HCl.
  2. En el caso de los medicamentos con concentraciones inferiores a 50 mg/ml, realizar el intercambio tampón siguiendo los pasos 2.2.1 a 2.2.5.
    1. Transfiera 20 mg de cada muestra a un dispositivo de filtro centrífugo de 10k (consulte la tabla de materiales) y centrifugue a 14.000 x g durante 25 min (a temperatura ambiente, RT) hasta que quede un volumen de aproximadamente 100 μL.
    2. Añadir 350 μL de 10 mM de histidina (ver Tabla de Materiales), tampón de pH 6,0 en el filtro, vórtice y centrifugar a 14.000 x g durante 25 min a RT. Repetir una vez.
    3. Invierta el filtro y colóquelo en el tubo de recolección de muestras, luego centrifugue las muestras a 1000 x g durante 5 minutos en RT para recuperar todo el volumen en el tubo de recolección. Lavar el filtro con 200 μL de tampón de histidina 10 mM y pipetear hacia arriba y hacia abajo para recuperar las muestras de proteínas restantes. Transfiera toda la solución al mismo tubo de recolección, vórtice y gire hacia abajo.
    4. Mida la concentración de la muestra con NanoDrop. Ajuste la concentración de cada muestra de proteína a 50 mg/ml añadiendo el tampón de histidina antes de la incubación con perlas de enriquecimiento.
    5. Transfiera 300 μL de la muestra a un tubo de microcentrífuga de 2 mL.

3. Preparación de perlas de enriquecimiento del proteoma

  1. Retire la tapa superior e inferior de cada columna de centrifugado obtenida del kit comercial de enriquecimiento de proteínas (consulte la Tabla de materiales). No deseche las tapas, ya que se usarán más adelante.
  2. Tome la columna de centrifugación y colóquela en un tubo de microcentrífuga de 2 ml sin tapón. Centrifugar la instalación a temperatura ambiente y 1.000 x g durante 30-60 s a RT para eliminar la solución de almacenamiento. Deseche el material recolectado durante este paso.
  3. Añada 200 μL de tampón de lavado a las perlas de enriquecimiento disponibles en el mercado (consulte la Tabla de materiales) y pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces. Coloque la columna de centrifugación en un tubo de microcentrífuga de 2 ml y centrifugue a 1.000 x g durante 30-60 s a RT para eliminar el tampón. Deseche el material recolectado.
    NOTA: El tampón de lavado está incluido en el kit comercial de enriquecimiento de proteínas.
  4. Repita los pasos 3.3 dos veces.
  5. Vuelva a colocar la tapa inferior y agregue 200 μL de agua, luego vuelva a colocar la tapa superior.

4. Enriquecimiento proteico

  1. Pipetear hacia arriba y hacia abajo el lodo (a partir del paso 3.5) y transferir 40 μL de lodo a la muestra preparada en el paso 2. Incubar y girar el tubo a temperatura ambiente durante 2 h.
  2. Haga una punta con frita (ver Tabla de materiales) usando la aguja de 16 G para obtener el tamaño de frita apropiado, luego insértela en el extremo de la punta de la punta de 200 μL.
  3. Transfiera la muestra con perlas a la punta preparada en el paso 4.2. Centrifugar la punta con un tubo de microcentrífuga de 2 ml a 200 x g durante 3 min a RT para eliminar la solución.
  4. Lave las perlas añadiendo 200 μL de tampón de lavado a la punta y centrifugue la punta con un tubo de microcentrífuga de 2 ml a 200 x g durante 2 min a RT para eliminar la solución de lavado. Repita el paso dos veces.
  5. Lave las perlas añadiendo 200 μL de agua a la punta y centrifugue la punta con un tubo de microcentrífuga de 2 mL a 200 x g durante 2 min a RT para eliminar el agua.
  6. Eluir las proteínas de las perlas añadiendo 10 μL de tampón de elución (paso 1.4) en la punta, y pipetear la suspensión diez veces en la punta para asegurarse de que las perlas estén empapadas con tampón de elución.
  7. Centrifugar la punta con un nuevo tubo de microcentrífuga de 0,5 ml a 200 x g durante 30 s a RT para recoger el eluyente. Repita los pasos 4.6-4.7 dos veces y combine toda la elución en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml.
  8. Añadir 1,5 μL de solución de tripsina (paso 1.5) en el eluyente para la digestión nocturna a 28 °C. Añadir 1,5 μL de 25 mg/mL de DTT (paso 1.6) y calentar la muestra a 90 °C durante 20 min.
  9. Añadir 1,5 μL de IAM de 0,25 M (paso 1.7) e incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 20 min. Añadir 3,5 μL de TFA al 10% (paso 1.8), vórtice durante 2 min, y asegurarse de que el pH esté en ~2-3.
  10. Centrifugar a 14.400 × g durante 10 min a RT para precipitar SDC y SLS. Recoja el sobrenadante para desalinizarlo.
  11. Realice la desalinización siguiendo los pasos que se indican a continuación.
    1. Añadir 50 μL de tampón B (paso 1.10) a la punta desalinizadora de GC (ver Tabla de Materiales). Centrifugar la punta con un soporte a 1000 x g durante 3 min a RT. Deseche el material recogido.
    2. Añadir 50 μL de tampón A (paso 1.9) a la punta. Centrifugar la punta con un soporte a 1000 x g durante 3 min a RT. Deseche el material recogido.
    3. Agregue la muestra acidificada a la punta. Centrifugar la punta con un soporte a 500 x g durante 6 min a RT. Deseche el material recogido.
    4. Lave la punta añadiendo 50 μL de tampón A a la punta. Centrifugar la punta con el soporte a 500 x g durante 3 min en RT. Deseche el material recogido. Repita una vez.
    5. Eluir el péptido de la punta añadiendo 50 μL de tampón B a la punta desalinizadora de GC. Centrifugar la punta con un tubo nuevo a 500 x g durante 3 min en RT. Recoger el material. Repita el paso una vez y combine el eluyente.
    6. Seque el eluyente con un concentrador de vacío (consulte la tabla de materiales).
  12. Vuelva a suspender el eluyente seco en 30 μL de solución de ácido fórmico (AF) al 0,1%.
  13. Mida los rayos UV de las mezclas de péptidos a 214 nm con un espectrofotómetro (consulte la tabla de materiales). La concentración de mezclas peptídicas debe oscilar entre 0,1 y 0,5 mg/ml.
  14. Transfiera 10 μL de cada muestra digerida a un vial de muestra LC, luego inyecte 1 μg de cada muestra digerida en nano LC-MS/MS (consulte la Tabla de materiales). Realice el análisis siguiendo el paso 5. Almacenar el resto de las muestras digeridas en un congelador a -80 °C.

5. Análisis Nano LC-MS/MS

  1. Inyecte la mezcla de péptidos en un sistema nano-LC acoplado a un espectrómetro de masas. Cargue las mezclas peptídicas (~1 μg) en una columna de trampa C18 con el gradiente proporcionado en la Tabla 1A para la desalinización y, a continuación, en una columna analítica C18 a 40 °C para la separación.
    NOTA: El tampón móvil de fase A consistió en 0,1% de AG en agua ultrapura, y la fase móvil B consistió en 0,1% de AG en 80% de ACN.
  2. Separar los péptidos y eluir con el gradiente proporcionado en la Tabla 1B con un caudal de 250 nL/min.
    NOTA: El espectrómetro de masas funcionó en modo dependiente de datos (DDA) con un tiempo de ciclo de 3 s. Los iones se sometieron a fragmentación a través de la disociación colisional (HCD) de mayor energía con una energía de colisión normalizada del 30% para cada exploración completa de MS. Los escaneos se realizaron con una resolución de 60.000, con un objetivo de control automático de ganancia (AGC) de 3e6, un tiempo máximo de inyección de 20 ms y un rango m/z de 380-1600. Los eventos MS/MS se llevaron a cabo con una resolución de 15.000, con un objetivo AGC de 1e5, un tiempo máximo de inyección de 60 ms y un rango m/z de 200-2000. La duración de la exclusión se fijó en 45 s. Las propiedades de la fuente de iones se proporcionan en la Tabla 1C, y los parámetros específicos de espectrometría de masas se pueden encontrar en la Tabla 2A-F.

6. Análisis de datos

  1. Realice una búsqueda en los archivos sin procesar de espectrometría de masas del NISTmAb en la base de datos UniProt mus+musculus29. Además, busque los archivos sin procesar de espectrometría de masas de mAb DS con proteína recombinante con picos en la base de datos UniProt Cricetulus Griseus30.
    NOTA: Estas búsquedas se realizaron en el software Proteome Discoverer (ver Tabla de Materiales) utilizando los motores de búsqueda Sequest HT y Mascot. Las bases de datos utilizadas estaban libres de entradas redundantes.
  2. Para las búsquedas de espectrometría de masas, aplique una tolerancia de masa de 10 ppm y establezca la tolerancia de masa del fragmento en 0,02 Da.
    NOTA: Los criterios de búsqueda abarcaron la carbamidometilación estática de residuos de cisteína (+57,0214 Da) y la modificación variable de la oxidación (+15,9949 Da) en residuos de metionina. Adicionalmente, se aplicó una modificación variable de la desaminación (+0.984 Da).
  3. Realice la búsqueda en la base de datos utilizando la digestión de tripsina, lo que permite un máximo de dos escisiones perdidas. Establezca las tasas de falsos descubrimientos tanto para proteínas como para péptidos en 0,01.
    NOTA: Para identificar positivamente las proteínas de la célula huésped (HCP), se aplicó un requisito mínimo de al menos dos péptidos únicos. En la Tabla 3 se presenta un resumen representativo de los profesionales de la salud identificados asociados con el AcM del NIST analizados por el software Proteome Discoverer.

Resultados

Este protocolo presentó un flujo de trabajo de preparación de muestras, denominado enriquecimiento de proteínas junto con digestión limitada (PMLD), para el análisis de proteínas de la célula huésped (HCP) en una muestra de anticuerpos monoclonales (mAb). La Figura 1 ilustra el procedimiento paso a paso de PMLD. Los investigadores compararon los resultados del análisis de HCP utilizando la digestión directa (que se muestra en el panel superior de la Figura 2) y PMLD (que se muestra...

Discusión

Hay dos versiones de perlas de enriquecimiento de proteínas disponibles comercialmente: una con una capacidad más pequeña y la otra con una capacidad más grande (ver Tabla de materiales). Ambas versiones de las perlas de enriquecimiento contienen diez preparaciones en el paquete. Las instrucciones del fabricante sugieren que cada preparación del kit de pequeña capacidad se puede usar para enriquecer 10 mg de proteína total. Sin embargo, para un rendimiento óptimo del enriquecimiento de proteínas...

Divulgaciones

Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Ninguno.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
16 G, Metal Hub Needle, 2 in, point style 3Hamilton91016
Acclaim PepMap 100 C18 trap column (20 cm × 0.075 mm)Thermo Fisher164535
AcetonitrileFisher-ScientificA955
Acetonitrile with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade Fisher-ScientificLS120-4
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter UnitMillipore SigmaUFC5010
C18 analytical column (0.075 mm × 1.7 μm × 30 cm, 100 Å)CoAnn TechnologiesHEB07503001718I
Centrifuge 5424Eppendorf5405000646
Dithiothreitol (DTT) Thermo FisherA39255
Frit for SPE cartridges, 9.5 mm, 3 mL, 100/pkAgilent12131020
GL-Tip GCGL Sciences Inc  7820-11201
in-house mAbRegeneronconcentration 200 mg/mL
Iodoacetamide (30 x 9.3 mg)Thermo FisherA39271
IsopropanolFisher-Scientific149320025
L-HistidineSigma AldrichH6034
L-Histidine monohydrochloride monohydrateSigma Aldrich53370
MethanolFisher-ScientificA456-4 
Milli-QMillpore30035
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000
Orbitrap Exploris 480Thermo FisherBRE725539
Protein LoBind Tube 0.5 mLEppendorf (VWR)22431064
Protein LoBind Tube 2.0 mLEppendorf (VWR)22431102
Proteome Discoverer software 2.4Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment Large-Capacity KitBio-Rad1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity KitBio-Rad1633006
Sodium deoxycholate (SDC)Sigma AldrichD6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) Sigma AldrichL5777
SpeedVacLabconco7970010
Thermomixer REppendorf22670107
Trifluoracetic acid (TFA)Fisher-Scientific28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified)  (5 x 20 ug)PromegaV5111
Tube Revolver RotatorThermo Fisher88881001
UltiMate 3000 RSLC nano systemThermo FisherULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0Thermo Fisher15568-025
Vortex Genie 2VWR102091-234
Water with 0.1% Formic Acid (v/v), Optima LC/MS Grade Fisher-ScientificLS118-4 

Referencias

  1. Aboulaich, N. A novel approach to monitor clearance of host cell proteins associated with monoclonal antibodies. Biotechnology Progress. 30 (5), 1114-1124 (2014).
  2. Goey, C. H., Alhuthali, S., Kontoravdi, C. Host cell protein removal from biopharmaceutical preparations: Towards the implementation of quality by design. Biotechnology Advances. 36 (4), 1223-1237 (2018).
  3. Levy, N. E., Valente, K. N., Choe, L. H., Lee, K. H., Lenhoff, A. M. Identification and characterization of host cell protein product-associated impurities in monoclonal antibody bioprocessing. Biotechnology and Bioengineering. 111 (5), 904-912 (2014).
  4. Molden, R. Host cell protein profiling of commercial therapeutic protein drugs as a benchmark for monoclonal antibody-based therapeutic protein development. MAbs. 13 (1), 1955811 (2021).
  5. Bee, J. S. Trace levels of the CHO host cell protease cathepsin D caused particle formation in a monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 31 (5), 1360-1369 (2015).
  6. Bracewell, D. G., Francis, R., Smales, C. M. The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control. Biotechnology and Bioengineering. 112 (9), 1727-1737 (2015).
  7. Chiu, J., et al. Knockout of a difficult-to-remove CHO host cell protein, lipoprotein lipase, for improved polysorbate stability in monoclonal antibody formulations. Biotechnology and Bioengineering. 114 (5), 1006-1015 (2017).
  8. Gilgunn, S., et al. Identification and tracking of problematic host cell proteins removed by a synthetic, highly functionalized nonwoven media in downstream bioprocessing of monoclonal antibodies. Journal of Chromatography A. 1595, 28-38 (2019).
  9. Graf, T. Identification and characterization of polysorbate-degrading enzymes in a monoclonal antibody formulation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (11), 3558-3567 (2021).
  10. Hall, T., Sandefur, S. L., Frye, C. C., Tuley, T. L., Huang, L. Polysorbates 20 and 80 degradation by group XV lysosomal phospholipase A2 isomer X1 in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 105 (5), 1633-1642 (2016).
  11. Jones, M. 34;High-risk" host cell proteins (HCPs): A multi-company collaborative view. Biotechnology and Bioengineering. 118 (8), 2870-2885 (2021).
  12. Li, X., et al. Identification and characterization of a residual host cell protein hexosaminidase B associated with N-glycan degradation during the stability study of a therapeutic recombinant monoclonal antibody product. Biotechnology Progress. 37 (3), e3128 (2021).
  13. Zhang, S. Identification of the specific causes of polysorbate 20 degradation in monoclonal antibody formulations containing multiple lipases. Pharmaceutical Research. 39 (1), 75-87 (2022).
  14. Zhang, S., Xiao, H., Li, N. Degradation of polysorbate 20 by Sialate O-Acetylesterase in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 110 (12), 3866-3873 (2021).
  15. Zhang, S., Xiao, H., Molden, R., Qiu, H., Li, N. Rapid polysorbate 80 degradation by liver carboxylesterase in a monoclonal antibody formulated drug substance at early stage development. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (11), 3300-3307 (2020).
  16. Gunawan, F. Comparison of platform host cell protein ELISA to process-specific host cell protein ELISA. Biotechnology and Bioengineering. 115 (2), 382-389 (2018).
  17. Chen, I. H., Xiao, H., Daly, T., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through molecular weight cutoff enrichment. Analytical Chemistry. 92 (5), 3751-3757 (2020).
  18. Chen, I. H., Xiao, H., Li, N. Improved host cell protein analysis in monoclonal antibody products through ProteoMiner. Analytical Biochemistry. 610, 113972 (2020).
  19. Doneanu, C. E., et al. Enhanced detection of low-abundance host cell protein impurities in high-purity monoclonal antibodies down to 1 ppm using ion mobility mass spectrometry coupled with multidimensional liquid chromatography. Analytical Chemistry. 87 (20), 10283-10291 (2015).
  20. Huang, L., et al. A Novel sample preparation for shotgun proteomics characterization of HCPs in antibodies. Analytical Chemistry. 89 (10), 5436-5444 (2017).
  21. Johnson, R. O., Greer, T., Cejkov, M., Zheng, X., Li, N. Combination of FAIMS, Protein A depletion, and native digest conditions enables deep proteomic profiling of host cell proteins in monoclonal antibodies. Analytical Chemistry. 92 (15), 10478-10484 (2020).
  22. Kreimer, S. Host cell protein profiling by targeted and untargeted analysis of data independent acquisition mass spectrometry data with parallel reaction monitoring verification. Analytical Chemistry. 89 (10), 5294-5302 (2017).
  23. Madsen, J. A., et al. Toward the complete characterization of host cell proteins in biotherapeutics via affinity depletions, LC-MS/MS, and multivariate analysis. MAbs. 7 (6), 1128-1137 (2015).
  24. Nie, S. Simple and sensitive method for deep profiling of host cell proteins in therapeutic antibodies by combining ultra-low trypsin concentration digestion, long chromatographic gradients, and boxcar mass spectrometry acquisition. Analytical Chemistry. 93 (10), 4383-4390 (2021).
  25. Yang, F. Versatile LC-MS-Based workflow with robust 0.1 ppm sensitivity for identifying residual HCPs in biotherapeutic products. Analytical Chemistry. 94 (2), 723-731 (2022).
  26. Zhang, Q. Comprehensive tracking of host cell proteins during monoclonal antibody purifications using mass spectrometry. MAbs. 6 (3), 659-670 (2014).
  27. Zhang, S., et al. Putative phospholipase B-Like 2 is not responsible for polysorbate degradation in monoclonal antibody drug products. Journal of Pharmaceutical Sciences. 109 (9), 2710-2718 (2020).
  28. Zhang, J., He, J., Smith, K. J. Fatty acids can induce the formation of proteinaceous particles in monoclonal antibody formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 111 (3), 655-662 (2022).
  29. Uniprot1. . , (2023).
  30. Uniprot2. . , (2023).

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