Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، تم الإبلاغ عن نظام لدراسة السلوكيات الجماعية للديدان الخيطية عن طريق استزراعها بكميات كبيرة باستخدام وسط أجار طعام. يسمح هذا النظام للباحثين بنشر أعداد كبيرة من ديدان dauer ويمكن تطبيقه على Caenorhabditis elegans والأنواع الأخرى ذات الصلة.

Abstract

تظهر سلوكيات جماعية ديناميكية ، كما لوحظ في أسراب الطيور ، ومجموعات الأسماك ، وحشود البشر. تم التحقيق في السلوكيات الجماعية للحيوانات في مجالات كل من علم الأحياء والفيزياء. في المختبر ، استخدم الباحثون نموذجية مختلفة مثل ذبابة الفاكهة وسمك الزرد لما يقرب من قرن من الزمان ، ولكن ظل تحديا كبيرا لدراسة السلوك الجماعي المعقد على نطاق واسع الذي تنظمه هذه النموذجية القابلة للتتبع وراثيا. تقدم هذه الورقة بروتوكولا لإنشاء نظام تجريبي للسلوكيات الجماعية في Caenorhabditis elegans. تتسلق الديدان المنتشرة على غطاء صفيحة بتري وتظهر سلوك جماعي للحشد. يتحكم النظام أيضا في تفاعلات الدودة وسلوكياتها عن طريق تغيير الرطوبة وتحفيز الضوء. يسمح لنا هذا النظام بفحص الآليات الكامنة وراء السلوكيات الجماعية من خلال تغيير الظروف البيئية وفحص آثار الحركة على المستوى الفردي على السلوكيات الجماعية باستخدام المسوخ. وبالتالي ، فإن النظام مفيد للبحث المستقبلي في كل من الفيزياء والبيولوجيا.

Introduction

كل من غير العلماء والعلماء مفتونون بالسلوكيات الجماعية للحيوانات ، كما هو الحال في أسراب الطيور ومجموعات الأسماك. تم تحليل السلوكيات الجماعية في مجموعة واسعة من المجالات ، بما في ذلك الفيزياء والبيولوجيا والرياضيات والروبوتات. على وجه الخصوص ، تعد فيزياء المادة النشطة مجالا بحثيا متناميا يركز على الأنظمة المكونة من عناصر ذاتية الدفع ، أي الأنظمة المبددة ، مثل أسراب الطيور ، ومجموعات الأسماك ، والأغشية الحيوية للبكتيريا المتحركة ، والهياكل الخلوية المكونة من جزيئات نشطة ، ومجموعات من الغرويات ذاتية الدفع. تؤكد نظرية فيزياء المادة الفعالة أنه مهما كانت سلوكيات الأفراد معقدة ، فإن الحركات الجماعية لأعداد هائلة من الكائنات الحية يحكمها عدد صغير من القواعد البسيطة. على سبيل المثال ، يتنبأ نموذج Vicsek ، وهو مرشح لوصف موحد للحركة الجماعية للجسيمات ذاتية الدفع ، بأن تفاعل المحاذاة قصير المدى للأجسام المتحركة مطلوب لتشكيل مرحلة مرتبة طويلة المدى مع تذبذب غريب الأطوار في 2D ، كما هو الحال في قطعان1. تتطور الأساليب التجريبية من أعلى إلى أسفل المتعلقة بفيزياء المادة الفعالة بسرعة. أكدت التجارب السابقة تشكيل مرحلة مرتبة بعيدة المدى في الإشريكية القولونية2. استخدمت أعمال حديثة أخرى الخلايا 3,4 ، البكتيريا5 ، الغرويات المتحركة6 ، أو البروتينات المتحركة 7,8. وصفت النماذج البسيطة البسيطة مثل نموذج Vicsek بنجاح هذه الظواهر الحقيقية. على النقيض من هذه الأنظمة التجريبية أحادية الخلية ، عادة ما يتم ملاحظة السلوكيات الجماعية للحيوانات في البرية ، حيث لا يمكن لأحد أن يأمل في إجراء تجارب خاضعة للرقابة مع 10000 طائر أو سمكة حقيقية.

يشترك علماء الأحياء في نفس الاهتمام مع الفيزيائيين: كيف يتفاعل الأفراد مع بعضهم البعض ويتصرفون وظيفيا كمجموعة. أحد مجالات البحث التقليدية لتحليل السلوك الفردي هو علم الأعصاب ، حيث تم فحص الآليات الكامنة وراء السلوك على المستويين العصبي والجزيئي. تم تطوير العديد من الأساليب العلمية العصبية من أسفل إلى أعلى حتى الآن. يمكن تسهيل النهج من أعلى إلى أسفل في الفيزياء والنهج من أسفل إلى أعلى في علم الأحياء باستخدام نموذجية مثل ذبابة الفاكهة ، والدودة Caenorhabditis elegans ، والفأر9. ومع ذلك ، كانت هناك نتائج قليلة حول السلوك الجماعي واسع النطاق لهذه النموذجية في المختبر10. لا يزال من الصعب إعداد نموذجية قابلة للتتبع وراثيا على نطاق واسع في المختبر. لذلك ، في الأبحاث الحالية حول السلوكيات الجماعية في علم الأحياء والفيزياء ، كان من الصعب على العلماء الذين يجرون عادة أبحاثا في المختبر دراسة السلوكيات الجماعية للحيوانات.

في هذه الدراسة ، أنشأنا طريقة لزراعة الديدان الخيطية على نطاق واسع لدراسة سلوكياتها الجماعية. يسمح لنا هذا النظام بتغيير الظروف البيئية وفحص تأثير الحركة على المستوى الفردي على السلوكيات الجماعية باستخدام الطفرات10. في فيزياء المادة الفعالة ، يمكن التحكم في معلمات النموذج الرياضي في كل من التجارب والمحاكاة ، مما يتيح التحقق من هذا النموذج لتحديد الأوصاف الموحدة. يستخدم علم الوراثة لفهم آلية الدائرة العصبية الكامنة وراء السلوك الجماعي11.

Protocol

1. تحضير الديدان

ملاحظة: قم بإعداد سلالة N2 Bristol من النوع البري12 وسلالة ZX899 (lite-1 (ce314) ؛ ljIs123 [mec-4p::ChR2 ، unc-122p :: RFP])13 لمراقبة السلوكيات الجماعية والتجارب البصرية الجينية ، على التوالي. حافظ على سلالة ZX899 في ظل الظروف المظلمة.

  1. قم بإيداع أربع ديدان بالغة جيدة التغذية على صفيحة 60 مم تحتوي على 14 مل من وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) مع أجار وبذرها بالإشريكية القولونية OP5012.
  2. تنمو ديدان F1 إلى الجوع في لوحة NGM عند 23 درجة مئوية لمدة 7 أيام. يبلغ إنتاج ديدان F1 حوالي 100 دودة / صفيحة في هذه المرحلة. تتكون مراحل الديدان من مجموعة مختلطة من يرقات dauer و L1 الجائعة.

2. إعداد لوحات أجار طعام (DFA) المتوسطة

  1. الأوتوكلاف زجاجة زجاجية تحتوي على 2 غرام من مسحوق طعام و 5 مل من وسط أجار 1٪ وتبريده إلى درجة حرارة الغرفة (الشكل 1 أ).
    ملاحظة: يمكن استخدام أطعمة الأخرى من مختلف الصانعين في هذه التجربة.

3. تلقيح الديدان إلى لوحات متوسطة DFA

  1. نقل كميات صغيرة (حوالي 0.5 غرام) من وسط DFA إلى وسط صفيحة NGM المصنفة بالإشريكية القولونية OP50 (الشكل 1B). للتجارب البصرية الوراثية ، صب 40 ميكرولتر من 50 ميكرومتر عبر شبكية العين بالكامل ، العامل المساعد لقناة رودوبسين 2 ، على DFA قبل تلقيح الديدان.
  2. اجمع الديدان الجائعة من أربع لوحات NGM باستخدام الماء المعقم.
  3. ضع جزءا صغيرا من طعام (حوالي 0.5 جم) على وسط DFA ، على بعد حوالي 2 مم من غطاء اللوحة.
  4. قم بإضاءة لوحة NGM بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة داخل مقعد نظيف لمنع التلوث.
  5. تلقيح الديدان المجمعة (حوالي 400 دودة) على وسط DFA على ألواح NGM. لا تغلق اللوحة بالبارافيلم لتجنب زيادة الرطوبة داخل صفيحة بتري وتوليد قطرات الماء التي تحبس الديدان على الغطاء.
  6. انشر الديدان عند 23 درجة مئوية واسمح لها بالصعود إلى غطاء اللوحة لمدة 10-14 يوما تقريبا.
    ملاحظة: نظرا لأن عدد الديدان الموجودة على الأغطية بالكاد زاد بعد 10-14 يوما ، فقد افترض أن الديدان قد نفدت من الطعام على الأرجح.

4. مراقبة السلوك الجماعي

  1. في يوم التجربة ، ضع صفيحة NGM جديدة لا تحتوي على E. coli ووسط أجار طعام على صفيحة من الألومنيوم على مرحلة مجهر التكبير الكلي (الشكل 2A). احتفظ بالجزء السفلي من لوحة NGM الجديدة عند 23 درجة مئوية باستخدام وحدة التحكم في درجة الحرارة من بلتيير لمدة 5 دقائق على الأقل (الشكل 2B). بعد ذلك ، استبدل غطاء لوحة NGM الجديدة بغطاء اللوحة التي صعدت إليها الديدان. استخدم العدسة الموضوعية (x2 ، NA = 0.5) كهدف تكبير منخفض (الشكل 2A).
  2. قم بزيادة درجة حرارة الجزء السفلي من لوحة بتري من 23 درجة مئوية إلى 26 درجة مئوية لتغيير الرطوبة داخل تلك اللوحة (الشكل 2).
  3. احصل على صور للسطح الداخلي لغطاء اللوحة باستخدام الكاميرا بمعدل 20 إطارا s−1 (الفيديو التكميلي S1).
  4. احفظ الصور التي تم الحصول عليها بتنسيق ملف الصورة الموسومة.

5. تجربة البصريات الوراثية

  1. استخدم مصباح زئبقي بقدرة 100 وات لتوصيل ضوء أزرق ، يتم ترشيحه باستخدام مجموعة مرشحات. تحكم في وقت الإضاءة بدقة باستخدام نظام الغالق الكهرومغناطيسي (الشكل 2 ب).
  2. حافظ على ZX899 على DFA في ظل هذه الظروف لمدة 5 دقائق قبل إضاءة الضوء الأزرق.
  3. قم بإضاءة ديدان ZX899 المتصلة بغطاء صفيحة بتري على مرحلة المجهر التي يتم الحفاظ عليها عند 23 درجة مئوية.
  4. احصل على صور للسطح الداخلي لغطاء اللوحة باستخدام كاميرا بمعدل 20 إطارا s−1 (الفيديو التكميلي S2).

النتائج

هنا ، تم استخدام ديدان dauer من النوع البري لمراقبة السلوك الجماعي. تمت زراعة الديدان عند 23 درجة مئوية لمدة 10-14 يوما تقريبا وصعدت إلى السطح الداخلي لغطاء صفيحة متوسطة DFA. في اليوم التجريبي ، تم نقل الغطاء فقط إلى لوحة NGM جديدة بدون وسط E. coli و DFA. تم الاحتفاظ بالجزء السفلي من صفيحة بتري هذه في...

Discussion

في هذه الدراسة ، نعرض بروتوكولا لإعداد نظام للسلوك الجماعي واسع النطاق ل C. elegans في المختبر. تم إنشاء الطريقة القائمة على DFA في الأصل مع Caenorhabditis japonica14 و Neoaplectana carpocapsae Weiser15 ، وكلاهما غير نموذجية. ومع ذلك ، لم يتم تطبيق هذه الطريقة للتحقيق في السلوكيات ا?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

Acknowledgements

نشكر مركز Caenorhabditis Genetics على توفير السلالات المستخدمة في هذه الدراسة. تم دعم هذا المنشور من قبل JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (رقم المنحة JP21H02532) ، JSPS KAKENHI Grant-in-Aid حول مشروع المجالات المبتكرة "Science of Soft Robot" (رقم المنحة JP18H05474) ، JSPS KAKENHI Grant-in-Aid لمجالات البحث التحويلي B (رقم المنحة JP23H03845) ، PRIME من الوكالة اليابانية للبحث والتطوير الطبي (رقم المنحة JP22gm6110022h9904) ، برنامج JST-Mirai (رقم المنحة JPMJMI22G3) ، وبرنامج JST-FOREST (رقم المنحة JPMJFR214R).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Escherichia coli and C. elegans strains
E. coli OP50Caenorhabditis Genetics CenterOP50Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.
lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP]authorZX899lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing ChR2 and RFP under the control of the mec-4 and unc-122 promoter, respectively
N2 BristrolCaenorhabditis Genetics CenterWild-type C. elegans strain
For worm cultivation
Agar purified, powderNakarai tesque01162-15For preparation of NGM plates
All-trans retinalSigma-AldrichR2500For optogenetics
Bacto peptonBecton Dickinson211677For preparation of NGM plates
Calcium chlorideWako036-00485For preparation of NGM plates
CholesterolWako034-03002For preparation of NGM plates
di-Photassium hydrogenphosphateNakarai tesque28727-95For preparation of NGM plates
Dog foodNihon Pet FoodVITA-ONEFor preparation of dog food agar medium
LB broth, LennoxNakarai tesque20066-95For culture of E. coli OP50
Magnesium sulfate anhydrousTGIM1890For preparation of NGM plates
Petri dishes (60 mm)Nunc150270For preparation of NGM plates
Potassium DihydrogenphosphateNakarai tesque28720-65For preparation of NGM plates
Sodium ChlorideNakarai tesque31320-05For preparation of NGM plates
Observation
ComputerCT solutionCS6229Windows10 Pro with Intel Xeon Gold 6238R CPU and 768 GB of RAM
CMOS CameraHamamatsu photonics ORCA-Lightning C14120-20PFor data acquisition
CMOS CameraOlympusDP74For data acquisition
Microscope with SZX-MGFP setOlympusMVX10For data acquisition
x2 Objective lensOlympusMV PLAPO 2XCWorking distance 20 mm and numerical aperture 0.5
Shutter control
ShutterOptoSigmaBSH2-RIXFor controlling temporal pattern of  light illumination
Shutter controllerOptoSigmaSSH-C2B-AFor controlling temporal pattern of  light illumination
Temperature control
Peltier temperature controller unitVICSWLVPU-30For controlling humidity inside a Petri plate
UNI-THEMO CONTROLLERAmpereUTC-100For controlling humidity inside a Petri plate
Data acquisition software
HCImageHamamatsu photonicsFor data acquisition

References

  1. Vicsek, T., Czirók, A., Ben-Jacob, E., Cohen, I., Shochet, O. Novel type of phase transition in a system of self-driven particles. Physical Review Letters. 75 (6), 1226-1229 (1995).
  2. Nishiguchi, D., Nagai, K. H., Chaté, H., Sano, M. Long-range nematic order and anomalous fluctuations in suspensions of swimming filamentous bacteria. Physical Review E. 95 (2), 020601-020606 (2017).
  3. Saw, T. B., et al. Topological defects in epithelia govern cell death and extrusion. Nature. 544 (7649), 212-216 (2017).
  4. Kawaguchi, K., Kageyama, R., Sano, M. Topological defects control collective dynamics in neural progenitor cell cultures. Nature. 545 (7654), 327-331 (2017).
  5. Chen, C., Liu, S., Shi, X., Chaté, H., Wu, Y. Weak synchronization and large-scale collective oscillation in dense bacterial suspensions. Nature. 542 (7640), 210-214 (2017).
  6. Bricard, A., Caussin, J. -. B., Desreumaux, N., Dauchot, O., Bartolo, D. Emergence of macroscopic directed motion in populations of motile colloids. Nature. 503 (7474), 95-98 (2013).
  7. Sumino, Y., et al. Large-scale vortex lattice emerging from collectively moving microtubules. Nature. 483 (7390), 448-452 (2012).
  8. Schaller, V., Weber, C., Semmrich, C., Frey, E., Bausch, A. R. Polar patterns of driven filaments. Nature. 467 (7311), 73-77 (2010).
  9. Lin, A., et al. Imaging whole-brain activity to understand behaviour. Nature Reviews Physics. 4 (5), 292-305 (2022).
  10. Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. C. elegans collectively forms dynamical networks. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
  11. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  12. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
  13. Stirman, J. N., et al. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 8 (2), 153-158 (2011).
  14. Tanaka, R., Okumura, E., Yoshiga, T. A simple method to collect phoretically active dauer larvae of Caenorhabditis japonica. Nematological Research. 40 (1), 7-12 (2010).
  15. Hara, A. H., Lindegren, J. E., Kaya, H. K. Monoxenic mass production of the entomogenous nematode Neoaplectana carpocapsae. Weiser on dog food/agar medium. 16, 1-8 (1981).
  16. de Bono, M., Bargmann, C. I. Natural variation in a neuropeptide Y receptor homolog modifies social behavior and food response in C. elegans. Cell. 94 (5), 679-689 (1998).
  17. Artyukhin, A. B., Yim, J. J., Cheong, M. C., Avery, L. Starvation-induced collective behavior in C. elegans. Scientific Reports. 5, 10647 (2015).
  18. Ding, S. S., Schumacher, L. J., Javer, A. E., Endres, R. G., Brown, A. E. Shared behavioral mechanisms underlie C. elegans aggregation and swarming. eLife. 8, 1181 (2019).
  19. Chen, Y., Ferrell, J. E. C. elegans colony formation as a condensation phenomenon. Nature Communications. 12 (1), 4947 (2021).
  20. Chiba, T., et al. Caenorhabditis elegans transfers across a gap under an electric field as dispersal behavior. Current Biology. 33 (13), 2668-2677 (2023).
  21. Ioannou, C. C., Guttal, V., Couzin, I. D. Predatory fish select for coordinated collective motion in virtual prey. Science. 337 (6099), 1212-1215 (2012).
  22. Couzin, I. D., Krause, J., Franks, N. R., Levin, S. A. Effective leadership and decision-making in animal groups on the move. Nature. 433 (7025), 513-516 (2005).
  23. Sumpter, D. J. T., Krause, J., James, R., Couzin, I. D., Ward, A. J. W. Consensus decision making by fish. Current Biology: CB. 18 (22), 1773-1777 (2008).
  24. Sugi, T., Nishida, Y., Mori, I. Regulation of behavioral plasticity by systemic temperature signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Neuroscience. 14 (8), 984-992 (2011).
  25. Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

198 Caenorhabditis elegans

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved