線虫の集団行動研究のための線虫の大規模培養

要約

ここでは、ドッグフード寒天培地を用いて線虫を一括培養し、線虫の集団行動を研究するシステムについて報告する。このシステムにより、研究者は多数のダウアーワームを繁殖させることができ、 Caenorhabditis elegans やその他の近縁種に適用できます。

要約

動物は、鳥の群れ、魚の群れ、人間の群れで観察されるように、ダイナミックな集団行動を示します。動物の集団行動は、生物学と物理学の両分野で研究されてきました。研究室では、約100年前からショウジョウバエやゼブラフィッシュなど様々なモデル動物を用いてきましたが、これらの遺伝的に扱いやすいモデル動物が司令する大規模で複雑な集団行動を研究することは大きな課題でした。この論文は、 Caenorhabditisエレガンスの集団行動の実験システムを作成するためのプロトコルを提示します。繁殖した線虫はペトリプレートの蓋に登り、集団的な群れ行動を示します。また、このシステムは、湿度と光刺激を変化させることで、線虫の相互作用と行動を制御します。このシステムにより、環境条件を変化させることで集団行動のメカニズムを調べたり、個体レベルの移動が集団行動に及ぼす影響を変異体を用いて調べたりすることができます。したがって、このシステムは、物理学と生物学の両方の将来の研究に役立ちます。

概要

非科学者も科学者も、鳥の群れや魚の群れなど、動物の集団行動に魅了されています。集団行動は、物理学、生物学、数学、ロボット工学など幅広い分野で解析されています。特に、鳥の群れ、魚の群れ、運動性細菌のバイオフィルム、活性分子からなる細胞骨格、自走コロイド群などの自走系、すなわち散逸系に着目した研究分野として、アクティブマター物理学が発展しています。アクティブマター物理学の理論では、個体の振る舞いがいかに複雑であっても、膨大な数の生物の集団運動は少数の単純な規則によって支配されていると主張しています。例えば、自走式粒子の集団運動の統一的記述の候補であるヴィクセックモデルは^{、動物の群れ}のように、2次元で偏心揺らぎを伴う長距離の秩序相を形成するためには、移動する物体の短距離整列相互作用が必要であると予測している1。アクティブマターの物理学に関するトップダウンの実験的アプローチは急速に発展しています。以前の実験では、大腸菌²の長距離秩序相の形成が確認されました。他の最近の研究では、細胞^3,4、細菌⁵、運動性コロイド⁶、または移動するタンパク質^7,8が用いられました。ヴィクセック模型のような単純な極小模型は、これらの現実の現象をうまく記述した。これらの単細胞実験系とは対照的に、動物による集団行動は野生で観察されるのが普通であり、10,000匹の本物の鳥や魚で対照実験を行うことは誰も望めません。

生物学者は物理学者と同じ関心を共有しており、個体が互いに相互作用し、グループとして機能的に振る舞う方法に関心を持っています。個人の行動を解析する伝統的な研究分野の一つに神経科学があり、その行動のメカニズムを神経細胞や分子レベルで調べてきました。これまでに多くの神経科学的なボトムアップアプローチが開発されてきました。物理学におけるトップダウンアプローチと生物学におけるボトムアップアプローチは、ショウジョウバエ、線虫 Caenorhabditis elegans、マウスなどのモデル動物を用いて促進することができる⁹。しかし、実験室でのこれらのモデル動物の大規模な集団行動に関する調査結果はほとんどありません¹⁰。遺伝的に扱いやすいモデル動物を実験室で大規模に作製することはまだ困難です。そのため、現在の生物学や物理学における集団行動の研究では、普段は実験室で研究をしている科学者が動物の集団行動を研究することが困難でした。

本研究では、線虫の集団行動を研究するために、線虫の大規模培養方法を確立した。このシステムにより、環境条件を変化させ、個体レベルの移動が集団行動に及ぼす影響を調べることができる¹⁰。アクティブマター物理学では、実験とシミュレーションの両方で数理モデルのパラメータを制御することができるため、そのモデルを検証して統一的な記述を特定することができます。遺伝学は、集団行動の根底にある神経回路のメカニズムを理解するために使用されます¹¹。

プロトコル

1.ワームの準備

注:集団行動の観察および光遺伝学的実験のために、野生型N2ブリストル株¹² およびZX899株(lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP])¹³ をそれぞれ調製する。ZX899ひずみを暗所で維持します。

1. 14 mLの線虫増殖培地(NGM)を含む60 mmプレートに、4匹の十分に摂餌された成虫を寒天培地とともに堆積させ、 大腸菌 OP50¹²を播種します。
2. F1線虫をNGMプレート内で23°Cで7日間飢餓状態まで増殖させます。この時点で、F1 ワームの収量は約 100 ウォーム/プレートです。線虫の段階は、ダウアー幼虫と飢餓状態のL1幼虫の混合集団で構成されています。

2.ドッグフード寒天(DFA)培地プレートの調製

1. 粉末ドッグフード2gと1%寒天培地5mLを入れたガラス瓶をオートクレーブし、室温まで冷却します(図1A)。
   注:この実験では、さまざまなメーカーの他のドッグフードを使用できます。

3. DFA培地プレートへのワームの接種

1. 少量(約0.5 g)のDFA培地を、 大腸菌 OP50を播種したNGMプレートの中央に移します(図1B)。光遺伝学的実験では、線虫を接種する前に、チャネルロドプシン2の補因子である50μMのオールトランスレチナール40μLをDFAに注ぎます。
2. オートクレーブ水を使用して、4つのNGMプレートから飢餓状態の線虫を回収します。
3. ドッグフードの小さな断片(約0.5 g)を、プレートの蓋から約2 mm離れたDFA培地に置きます。
4. 汚れを防ぐために、クリーンベンチ内でNGMプレートを紫外線で15分間照らします。
5. 採取した線虫(約400匹の線虫)をNGMプレート上のDFA培地に接種します。ペトリプレート内の湿度が上昇し、水滴が発生して蓋にワームが閉じ込められるのを防ぐために、プレートをパラフィルムで密封しないでください。
6. ワームを23°Cで繁殖させ、約10〜14日間プレートの蓋まで登らせます。
   注:蓋の上のワームの数は10〜14日後にほとんど増加しなかったため、ワームはおそらく餌を使い果たしたと推定されました。

4.集団行動の観察

1. 実験当日は、大 腸菌 とドッグフード寒天培地を含まない新しいNGMプレートを、マクロズーム顕微鏡のステージ上のアルミプレート上に置きます(図2A)。この新しいNGMプレートの底部を、ペルチェ温度コントローラーユニットを使用して23°Cに少なくとも5分間保持します(図2B)。次に、この新しいNGMプレートの蓋を、ワームが登ったプレートの蓋と交換します。対物レンズ(x2、NA = 0.5)を低倍率対物レンズとして使用します(図2A)。
2. ペトリプレートの底部の温度を23°Cから26°Cに上げて、プレート内の湿度を変化させます(図2)。
3. 板蓋内面の画像を20フレーム^s-1 でカメラで取得します(補足動画S1)。
4. 取り込んだ画像をタグ付き画像ファイル形式で保存します。

5. 光遺伝学的実験

1. 100Wの水銀ランプを使用して、フィルターセットでフィルタリングされたブルーライトを照射します。電磁シャッターシステムを使用して照明時間を正確に制御します(図2B)。
2. 青色光を照射する前に、これらの条件下でZX899をDFAに5分間維持します。
3. 23°Cに維持された顕微鏡ステージ上のペトリプレートの蓋に取り付けられたZX899ワームを照射します。
4. 板蓋内面の画像を20フレームs⁻¹ のカメラで取得する(補足動画S2)。

結果

ここでは、野生型のダウアーワームを集団行動の観察に用いた。線虫を23°Cで約10〜14日間培養し、DFA培地プレートの蓋の内面まで登った。実験当日は、蓋のみを大 腸菌 とDFA培地を含まない新しいNGMプレートに移しました。このペトリプレートの底部は、ペルチェシステムを用いて最初に23°Cに保たれ、その後、その温度を26°Cに上げました。 顕微鏡で動画を撮影しました。

ディスカッション

本研究では、線虫の大規模集団行動のためのシステムを実験室で準備するためのプロトコルを示します。DFA法は、もともと非モデル動物であるCaenorhabditis japonica¹⁴とNeoaplectana carpocapsae Weiser¹⁵で確立されました。しかし、この方法は集団行動の調査には適用されませんでした。C.エレガンスは遺伝的に扱いやすいモデル動物

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Escherichia coli and C. elegans strains
E. coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center	OP50	Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.
lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP]	author	ZX899	lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing ChR2 and RFP under the control of the mec-4 and unc-122 promoter, respectively
N2 Bristrol	Caenorhabditis Genetics Center		Wild-type C. elegans strain
For worm cultivation
Agar purified, powder	Nakarai tesque	01162-15	For preparation of NGM plates
All-trans retinal	Sigma-Aldrich	R2500	For optogenetics
Bacto pepton	Becton Dickinson	211677	For preparation of NGM plates
Calcium chloride	Wako	036-00485	For preparation of NGM plates
Cholesterol	Wako	034-03002	For preparation of NGM plates
di-Photassium hydrogenphosphate	Nakarai tesque	28727-95	For preparation of NGM plates
Dog food	Nihon Pet Food	VITA-ONE	For preparation of dog food agar medium
LB broth, Lennox	Nakarai tesque	20066-95	For culture of E. coli OP50
Magnesium sulfate anhydrous	TGI	M1890	For preparation of NGM plates
Petri dishes (60 mm)	Nunc	150270	For preparation of NGM plates
Potassium Dihydrogenphosphate	Nakarai tesque	28720-65	For preparation of NGM plates
Sodium Chloride	Nakarai tesque	31320-05	For preparation of NGM plates
Observation
Computer	CT solution	CS6229	Windows10 Pro with Intel Xeon Gold 6238R CPU and 768 GB of RAM
CMOS Camera	Hamamatsu photonics	ORCA-Lightning C14120-20P	For data acquisition
CMOS Camera	Olympus	DP74	For data acquisition
Microscope with SZX-MGFP set	Olympus	MVX10	For data acquisition
x2 Objective lens	Olympus	MV PLAPO 2XC	Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5
Shutter control
Shutter	OptoSigma	BSH2-RIX	For controlling temporal pattern of  light illumination
Shutter controller	OptoSigma	SSH-C2B-A	For controlling temporal pattern of  light illumination
Temperature control
Peltier temperature controller unit	VICS	WLVPU-30	For controlling humidity inside a Petri plate
UNI-THEMO CONTROLLER	Ampere	UTC-100	For controlling humidity inside a Petri plate
Data acquisition software
HCImage	Hamamatsu photonics		For data acquisition