Kolektif davranışlarını incelemek için nematodların büyük ölçekli ekimi

Özet

Burada, nematodların toplu davranışlarını, köpek maması agar ortamı kullanılarak toplu olarak kültürlenerek incelemek için bir sistem rapor edilmiştir. Bu sistem, araştırmacıların çok sayıda dauer solucanını çoğaltmasına izin verir ve Caenorhabditis elegans ve diğer ilgili türlere uygulanabilir.

Özet

Hayvanlar, kuş sürülerinde, balık sürülerinde ve insan kalabalığında gözlemlendiği gibi dinamik kolektif davranışlar sergilerler. Hayvanların kolektif davranışları hem biyoloji hem de fizik alanlarında araştırılmıştır. Laboratuvarda, araştırmacılar yaklaşık bir yüzyıl boyunca meyve sineği ve zebra balığı gibi çeşitli model hayvanları kullandılar, ancak bu genetik olarak izlenebilir model hayvanlar tarafından düzenlenen büyük ölçekli karmaşık kolektif davranışları incelemek büyük bir zorluk olmaya devam etti. Bu makale, Caenorhabditis elegans'ta deneysel bir kolektif davranış sistemi oluşturmak için bir protokol sunmaktadır. Yayılan solucanlar Petri plakasının kapağına tırmanır ve toplu sürü davranışı gösterir. Sistem ayrıca nemi ve ışık stimülasyonunu değiştirerek solucan etkileşimlerini ve davranışlarını kontrol eder. Bu sistem, çevresel koşulları değiştirerek kolektif davranışların altında yatan mekanizmaları incelememizi ve mutantları kullanarak bireysel düzeydeki hareketin kolektif davranışlar üzerindeki etkilerini incelememizi sağlar. Bu nedenle, sistem hem fizik hem de biyolojide gelecekteki araştırmalar için yararlıdır.

Giriş

Hem bilim adamı olmayanlar hem de bilim adamları, kuş sürülerinde ve balık sürülerinde olduğu gibi hayvanların kolektif davranışlarından etkilenirler. Kolektif davranışlar fizik, biyoloji, matematik ve robotik dahil olmak üzere çok çeşitli alanlarda analiz edilmiştir. Özellikle, aktif madde fiziği, kendinden tahrikli elemanlardan oluşan sistemlere, yani kuş sürüleri, balık sürüleri, hareketli bakterilerin biyofilmleri, aktif moleküllerden oluşan hücre iskeletleri ve kendinden tahrikli kolloid grupları gibi enerji tüketen sistemlere odaklanan büyüyen bir araştırma alanıdır. Aktif madde fiziği teorisi, bireylerin davranışları ne kadar karmaşık olursa olsun, çok sayıda canlının kolektif hareketlerinin az sayıda basit kural tarafından yönetildiğini savunur. Örneğin, kendinden tahrikli parçacıkların kolektif hareketinin birleşik bir tanımı için bir aday olan Vicsek modeli, hayvan sürülerinde olduğu gibi, 2B'de eksantrik dalgalanma ile uzun menzilli sıralı bir faz oluşturmak için hareketli nesnelerin kısa menzilli hizalama etkileşiminin gerekli olduğunu öngörmektedir¹. Aktif madde fiziği ile ilgili yukarıdan aşağıya deneysel yaklaşımlar hızla gelişmektedir. Önceki deneyler, Escherichia coli^2'de uzun menzilli sıralı bir fazın oluşumunu doğruladı. Diğer son çalışmalarda hücreler ^3,4, bakteriler⁵, hareketli kolloidler⁶ veya hareketli proteinler ^7,8 kullanılmıştır. Vicsek modeli gibi basit minimal modeller bu gerçek fenomenleri başarıyla tanımladı. Bu tek hücreli deney sistemlerinin aksine, hiç kimse 10.000 gerçek kuş veya balıkla kontrollü deneyler yapmayı umamayacağından, hayvanların kolektif davranışları genellikle vahşi doğada gözlemlenir.

Biyologlar fizikçilerle aynı ilgiyi paylaşırlar: bireylerin birbirleriyle nasıl etkileşime girdikleri ve işlevsel olarak bir grup olarak nasıl davrandıkları. Bireysel davranışı analiz etmek için kullanılan geleneksel araştırma alanlarından biri, davranışın altında yatan mekanizmaların nöronal ve moleküler düzeyde incelendiği sinirbilimdir. Şimdiye kadar birçok nörobilimsel aşağıdan yukarıya yaklaşım geliştirilmiştir. Fizikte yukarıdan aşağıya yaklaşımlar ve biyolojide aşağıdan yukarıya yaklaşımlar, meyve sineği, solucan Caenorhabditis elegans ve fare gibi model hayvanlar kullanılarak kolaylaştırılabilir⁹. Bununla birlikte, bu model hayvanların laboratuvardaki büyük ölçekli kolektif davranışları hakkında çok az bulgu vardır¹⁰; Genetik olarak izlenebilir model hayvanları laboratuvarda büyük ölçekte hazırlamak hala zordur. Bu nedenle, biyoloji ve fizikteki kolektif davranışlar üzerine yapılan güncel araştırmalarda, genellikle laboratuvarda araştırma yapan bilim adamlarının hayvanların kolektif davranışlarını incelemesi zor olmuştur.

Bu çalışmada, nematodların kolektif davranışlarını incelemek için büyük ölçekli yetiştiriciliği için bir yöntem oluşturduk. Bu sistem, çevresel koşulları değiştirmemize ve mutantları kullanarak bireysel düzeydeki hareketin kolektif davranışlar üzerindeki etkisini incelememize^{olanak tanır 10}. Aktif madde fiziğinde, matematiksel modelin parametreleri hem deneylerde hem de simülasyonlarda kontrol edilebilir, bu da birleşik açıklamaları tanımlamak için bu modelin doğrulanmasını sağlar. Genetik, kolektif davranışın altında yatan nöral devre mekanizmasını anlamak için kullanılır¹¹.

Protokol

1. Solucanların hazırlanması

NOT: Vahşi tip N2 Bristol suşu¹² ve ZX899 suşunu hazırlayın (lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP]⁾¹³ sırasıyla kolektif davranışların ve optogenetik deneylerin gözlemlenmesi için. ZX899 gerginliğini karanlık koşullarda koruyun.

1. Agar ile 14 mL nematod büyüme ortamı (NGM) içeren ve E. coli OP50¹² ile tohumlanmış 60 mm'lik bir plaka üzerine dört iyi beslenmiş yetişkin solucan biriktirin.
2. F1 solucanlarını NGM plakasında 7 gün boyunca 23 °C'de açlıktan ölün. F1 solucanlarının verimi bu noktada yaklaşık 100 solucan/plakadır. Solucanların aşamaları, karışık bir dauer ve aç L1 larvası popülasyonu içerir.

2. Köpek maması agar (DFA) orta boy plakalarının hazırlanması

1. 2 g toz köpek maması ve 5 mL %1 agar ortamı içeren bir cam şişeyi otoklavlayın ve oda sıcaklığına soğutun (Şekil 1A).
   NOT: Bu deneyde farklı üreticilerin diğer köpek mamaları kullanılabilir.

3. Solucanların DFA orta plakalarına aşılanması

1. E. coli OP50 ile tohumlanmış bir NGM plakasının merkezine küçük miktarlarda (yaklaşık 0.5 g) DFA ortamı aktarın (Şekil 1B). Optogenetik deneyler için, solucanların aşılanmasından önce kanal rodopsin 2'nin kofaktörü olan 40 μL 50 μM all-trans-retinal dökün.
2. Açlıktan ölen solucanları otoklavlanmış su kullanarak dört NGM plakasından toplayın.
3. DFA ortamına, tabağın kapağından yaklaşık 0.5 mm uzağa küçük bir köpek maması parçası (yaklaşık 2 g) yerleştirin.
4. Kontaminasyonu önlemek için NGM plakasını temiz bir tezgah içinde 15 dakika boyunca ultraviyole ışıkla aydınlatın.
5. Toplanan solucanları (yaklaşık 400 solucan) NGM plakaları üzerindeki DFA ortamına aşılayın. Petri plakasının içindeki nemin artmasını ve solucanları bir kapakta hapseden su damlacıkları oluşturmasını önlemek için plakayı parafilm ile kapatmayın.
6. Solucanları 23 °C'de çoğaltın ve yaklaşık 10-14 gün boyunca plakanın kapağına kadar tırmanmalarına izin verin.
   NOT: Kapaklardaki solucanların sayısı 10-14 gün sonra neredeyse hiç artmadığından, solucanların muhtemelen yiyeceklerinin bittiği varsayılmıştır.

4. Kolektif davranışın gözlemlenmesi

1. Deney gününde, E. coli ve köpek maması agar ortamı içermeyen yeni bir NGM plakasını, bir makro zoom mikroskobu sahnesinde bir alüminyum plaka üzerine yerleştirin (Şekil 2A). Bu yeni NGM plakasının altını bir Peltier sıcaklık kontrol ünitesi kullanarak en az 23 dakika boyunca 5 °C'de tutun (Şekil 2B). Ardından, bu yeni NGM plakasının kapağını, solucanların tırmandığı plakanın kapağıyla değiştirin. Düşük büyütmeli objektif olarak objektif lensi (x2, NA = 0.5) kullanın (Şekil 2A).
2. Petri plakasının içindeki nemi değiştirmek için Petri plakasının tabanının sıcaklığını 23 °C'den 26 °C'ye yükseltin (Şekil 2).
3. Kamera ile plaka kapağının iç yüzeyinin görüntülerini 20 kare s^−1'de alın (Ek Video S1).
4. Alınan görüntüleri Etiketli Görüntü Dosyası biçiminde kaydedin.

5. Optogenetik deney

1. Mavi ışık vermek için bir filtre seti ile filtrelenmiş 100 W cıvalı bir lamba kullanın. Elektromanyetik bir deklanşör sistemi kullanarak aydınlatma süresini hassas bir şekilde kontrol edin (Şekil 2B).
2. ZX899'u bu koşullar altında DFA'da mavi ışık aydınlatmasından önce 5 dakika koruyun.
3. 23 °C'de tutulan mikroskop aşamasında bir Petri plakasının kapağına takılan ZX899 solucanlarını aydınlatın.
4. 20 kare s^−1'de bir kamera ile plaka kapağının iç yüzeyinin görüntülerini alın (Ek Video S2).

Sonuçlar

Burada, kolektif davranış gözlemleri için vahşi tip dauer solucanları kullanılmıştır. Solucanlar yaklaşık 10-14 gün boyunca 23 ° C'de yetiştirildi ve bir DFA orta plakasının kapağının iç yüzeyine tırmandı. Deney gününde, sadece kapak E. coli ve DFA besiyeri olmayan yeni bir NGM plakasına aktarıldı. Bu Petri plakasının tabanı başlangıçta Peltier sistemi kullanılarak 23 °C'de tutuldu ve daha sonra sıcaklığı 26 °C'ye çıkarıldı. Mikroskop altında bir film çekildi.

Tartışmalar

Bu çalışmada, C. elegans'ın laboratuvardaki büyük ölçekli kolektif davranışı için bir sistem hazırlamak için bir protokol gösteriyoruz. DFA tabanlı yöntem ilk olarak, her ikisi de model olmayan hayvanlar olan Caenorhabditis japonica¹⁴ ve Neoaplectana carpocapsae Weiser¹⁵ ile kurulmuştur. Ancak bu yöntem kolektif davranışların araştırılmasında uygulanmamıştır. C. elegans, genetik olarak izlenebilir bir model ha...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Escherichia coli and C. elegans strains
E. coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center	OP50	Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.
lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP]	author	ZX899	lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing ChR2 and RFP under the control of the mec-4 and unc-122 promoter, respectively
N2 Bristrol	Caenorhabditis Genetics Center		Wild-type C. elegans strain
For worm cultivation
Agar purified, powder	Nakarai tesque	01162-15	For preparation of NGM plates
All-trans retinal	Sigma-Aldrich	R2500	For optogenetics
Bacto pepton	Becton Dickinson	211677	For preparation of NGM plates
Calcium chloride	Wako	036-00485	For preparation of NGM plates
Cholesterol	Wako	034-03002	For preparation of NGM plates
di-Photassium hydrogenphosphate	Nakarai tesque	28727-95	For preparation of NGM plates
Dog food	Nihon Pet Food	VITA-ONE	For preparation of dog food agar medium
LB broth, Lennox	Nakarai tesque	20066-95	For culture of E. coli OP50
Magnesium sulfate anhydrous	TGI	M1890	For preparation of NGM plates
Petri dishes (60 mm)	Nunc	150270	For preparation of NGM plates
Potassium Dihydrogenphosphate	Nakarai tesque	28720-65	For preparation of NGM plates
Sodium Chloride	Nakarai tesque	31320-05	For preparation of NGM plates
Observation
Computer	CT solution	CS6229	Windows10 Pro with Intel Xeon Gold 6238R CPU and 768 GB of RAM
CMOS Camera	Hamamatsu photonics	ORCA-Lightning C14120-20P	For data acquisition
CMOS Camera	Olympus	DP74	For data acquisition
Microscope with SZX-MGFP set	Olympus	MVX10	For data acquisition
x2 Objective lens	Olympus	MV PLAPO 2XC	Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5
Shutter control
Shutter	OptoSigma	BSH2-RIX	For controlling temporal pattern of  light illumination
Shutter controller	OptoSigma	SSH-C2B-A	For controlling temporal pattern of  light illumination
Temperature control
Peltier temperature controller unit	VICS	WLVPU-30	For controlling humidity inside a Petri plate
UNI-THEMO CONTROLLER	Ampere	UTC-100	For controlling humidity inside a Petri plate
Data acquisition software
HCImage	Hamamatsu photonics		For data acquisition