טיפוח בקנה מידה גדול של נמטודות כדי ללמוד את ההתנהגויות הקולקטיביות שלהם

Summary

כאן, מדווח על מערכת לחקר התנהגויות קולקטיביות של נמטודות על ידי טיפוחן בכמויות גדולות באמצעות מדיום אגר מזון לכלבים. מערכת זו מאפשרת לחוקרים להפיץ מספר גדול של תולעי דאואר וניתן ליישם אותה על Caenorhabditis elegans ומינים קרובים אחרים.

Abstract

בעלי חיים מפגינים התנהגויות קולקטיביות דינמיות, כפי שנצפה בלהקות ציפורים, להקות דגים והמוני בני אדם. ההתנהגויות הקולקטיביות של בעלי חיים נחקרו בתחומי הביולוגיה והפיזיקה. במעבדה, חוקרים השתמשו בחיות מודל שונות כגון זבוב הפירות ודגי הזברה במשך כמאה שנה, אך נותר אתגר גדול לחקור התנהגות קולקטיבית מורכבת בקנה מידה גדול המתוזמרת על ידי חיות מודל גנטיות אלה. מאמר זה מציג פרוטוקול ליצירת מערכת ניסיונית של התנהגויות קולקטיביות ב- Caenorhabditis elegans. התולעים המתפשטות מטפסות על מכסה צלחת הפטרי ומראות התנהגות נחיל קולקטיבית. המערכת גם שולטת באינטראקציות ובהתנהגויות של תולעים על ידי שינוי הלחות וגירוי האור. מערכת זו מאפשרת לנו לבחון את המנגנונים העומדים בבסיס התנהגויות קולקטיביות על ידי שינוי תנאי הסביבה ובחינת ההשפעות של תנועה ברמת הפרט על התנהגויות קולקטיביות באמצעות מוטנטים. לפיכך, המערכת שימושית למחקר עתידי הן בפיזיקה והן בביולוגיה.

Introduction

הן הלא-מדענים והן המדענים מוקסמים מהתנהגויות קולקטיביות של בעלי חיים, כמו בלהקות ציפורים ובלהקות דגים. התנהגויות קולקטיביות נותחו במגוון רחב של תחומים, כולל פיזיקה, ביולוגיה, מתמטיקה ורובוטיקה. בפרט, פיזיקת החומר הפעיל היא תחום מחקר הולך וגדל המתמקד במערכות המורכבות מיסודות בעלי הנעה עצמית, כלומר מערכות מפזרות, כגון להקות ציפורים, להקות דגים, ביופילמים של חיידקים תנועתיים, שלדים ציטושלדים המורכבים ממולקולות פעילות, וקבוצות של קולואידים בעלי הנעה עצמית. התיאוריה של פיזיקת החומר הפעיל גורסת כי ככל שהתנהגותם של יחידים מורכבת, תנועותיהם הקולקטיביות של מספר עצום של יצורים חיים נשלטות על ידי מספר קטן של כללים פשוטים. לדוגמה, מודל Vicsek, מועמד לתיאור מאוחד של התנועה הקולקטיבית של חלקיקים בעלי הנעה עצמית, חוזה כי אינטראקציית יישור לטווח קצר של עצמים נעים נדרשת כדי ליצור פאזה מסודרת לטווח ארוך עם תנודות אקסצנטריות בדו-ממד, כמו בעדרי בעלי חיים¹. גישות ניסיוניות מלמעלה למטה הנוגעות לפיזיקה של חומר פעיל מתפתחות במהירות. ניסויים קודמים אישרו היווצרות של שלב מסודר ארוך טווח ב- Escherichia coli². עבודות אחרות שנעשו לאחרונה עסקו בתאים ^3,4, חיידקים⁵, קולואידים תנועתיים⁶, או חלבונים נעים ^7,8. מודלים מינימליים פשוטים כמו מודל ויצ'ק תיארו בהצלחה את התופעות האמיתיות הללו. בניגוד למערכות ניסויים חד-תאיות אלה, התנהגויות קולקטיביות של בעלי חיים נצפות בדרך כלל בטבע, מכיוון שאיש לא יכול היה לקוות לבצע ניסויים מבוקרים עם 10,000 ציפורים או דגים אמיתיים.

ביולוגים חולקים את אותו עניין כמו פיזיקאים: כיצד פרטים מתקשרים זה עם זה ומתנהגים באופן פונקציונלי כקבוצה. אחד מתחומי המחקר המסורתיים לניתוח התנהגות הפרט הוא מדעי המוח, שבו נבדקו המנגנונים העומדים בבסיס ההתנהגות ברמה העצבית והמולקולרית. גישות רבות של מדעי המוח מלמטה למעלה פותחו עד כה. ניתן להקל על גישות מלמעלה למטה בפיזיקה וגישות מלמטה למעלה בביולוגיה באמצעות חיות מודל כגון זבוב הפירות, התולעת Caenorhabditis elegans והעכבר⁹. עם זאת, היו מעט ממצאים על ההתנהגות הקולקטיבית בקנה מידה גדול של חיות מודל אלה במעבדה¹⁰; עדיין קשה להכין חיות מודל גנטיות בקנה מידה גדול במעבדה. לכן, במחקר הנוכחי על התנהגויות קולקטיביות בביולוגיה ובפיזיקה, קשה למדענים שבדרך כלל חוקרים במעבדה לחקור התנהגויות קולקטיביות של בעלי חיים.

במחקר זה ביססנו שיטה לטיפוח בקנה מידה גדול של נמטודות כדי לחקור את ההתנהגויות הקולקטיביות שלהן. מערכת זו מאפשרת לנו לשנות את תנאי הסביבה ולבחון את ההשפעה של תנועה ברמת הפרט על התנהגויות קולקטיביות באמצעות מוטנטים¹⁰. בפיזיקה של חומר פעיל, ניתן לשלוט בפרמטרים של המודל המתמטי הן בניסויים והן בסימולציות, מה שמאפשר אימות של אותו מודל לזיהוי תיאורים אחידים. גנטיקה משמשת להבנת מנגנון המעגל העצבי העומד בבסיס ההתנהגות הקולקטיבית¹¹.

Protocol

1. הכנת תולעים

הערה: הכינו את זן בריסטול^{N2 מסוג פרא 12} ואת זן ZX899 (לייט-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP])¹³ לתצפית על התנהגויות קולקטיביות וניסויים אופטוגנטיים, בהתאמה. שמור על זן ZX899 בתנאי חושך.

1. הפקידו ארבע תולעים בוגרות מוזנות היטב על צלחת 60 מ"מ המכילה 14 מ"ל של מדיום גידול נמטודות (NGM) עם אגר וזרעים עם E. coli OP50¹².
2. לגדל תולעי F1 לרעב בצלחת NGM ב 23 ° C במשך 7 ימים. התפוקה של תולעי F1 היא כ-100 תולעים לצלחת בשלב זה. שלבי התולעים מהווים אוכלוסייה מעורבת של זחלי דאואר וזחלי L1 מורעבים.

2. הכנת צלחות בינוניות אגר מזון לכלבים (DFA)

1. הוציאו בקבוק זכוכית שהכיל 2 גרם אבקת מזון לכלבים ו-5 מ"ל של 1% אגר בינוני וקררו אותו לטמפרטורת החדר (איור 1A).
   הערה: ניתן להשתמש במזונות כלבים אחרים מיצרנים שונים בניסוי זה.

3. חיסון תולעים ללוחות בינוניים DFA

1. העבירו כמויות קטנות (כ-0.5 גרם) של תווך DFA למרכז צלחת NGM שנזרעה עם E. coli OP50 (איור 1B). עבור ניסויים אופטוגנטיים, יש לשפוך 40 μL של 50 מיקרומטר all-trans-retinal, הקו-פקטור של ערוץ רודופסין 2, על DFA לפני חיסון תולעים.
2. אספו את התולעים המורעבות מארבע צלחות NGM באמצעות מים אוטוקלאביים.
3. הניחו שבר קטן של מזון כלבים (כ-0.5 גרם) על מדיום DFA, במרחק של כ-2 מ"מ ממכסה הצלחת.
4. האירו את צלחת הגז הטבעי באור אולטרה סגול למשך 15 דקות בתוך ספסל נקי כדי למנוע זיהום.
5. חסן את התולעים שנאספו (כ-400 תולעים) על תווך DFA על לוחות NGM. אין לאטום את הצלחת בפרפילם כדי למנוע הגברת הלחות בתוך צלחת הפטרי ויצירת טיפות מים שלוכדות תולעים על מכסה.
6. להפיץ את התולעים ב 23 מעלות צלזיוס ולאפשר להם לטפס עד מכסה הצלחת במשך כ 10-14 ימים.
   הערה: מכיוון שמספר התולעים על העפעפיים בקושי גדל לאחר 10-14 יום, ההנחה הייתה שככל הנראה נגמר המזון לתולעים.

4. תצפית על התנהגות קולקטיבית

1. ביום הניסוי, הניחו צלחת NGM חדשה שלא כללה E. coli ומדיום אגר מזון לכלבים על צלחת אלומיניום על הבמה של מיקרוסקופ זום מאקרו (איור 2A). שמרו את החלק התחתון של לוח הגז הטבעי החדש הזה בטמפרטורה של 23°C באמצעות יחידת בקר טמפרטורה של פלטייה למשך 5 דקות לפחות (איור 2B). לאחר מכן, החליפו את המכסה של צלחת NGM חדשה זו במכסה הצלחת שעליה טיפסו התולעים. השתמשו בעדשת האובייקט (x2, NA = 0.5) כמטרת הגדלה נמוכה (איור 2A).
2. הגדילו את הטמפרטורה של תחתית צלחת הפטרי מ-23°C ל-26°C כדי לשנות את הלחות בתוך הצלחת (איור 2).
3. קבל תמונות של המשטח הפנימי של מכסה הלוח עם המצלמה ב- 20 פריימים s⁻¹ (וידאו משלים S1).
4. שמור את התמונות שנרכשו בתבנית Tagged Image File.

5. ניסוי אופטוגנטי

1. השתמש במנורת כספית של 100 ואט כדי לספק אור כחול, מסונן באמצעות ערכת מסנן. שלוט בזמן ההארה במדויק באמצעות מערכת תריסים אלקטרומגנטית (איור 2B).
2. שמרו על ZX899 ב-DFA בתנאים אלה למשך 5 דקות לפני הדלקת האור הכחול.
3. להאיר תולעים ZX899 המחוברות למכסה של צלחת פטרי על במת המיקרוסקופ נשמר ב 23 ° C.
4. קבל תמונות של המשטח הפנימי של מכסה הלוח באמצעות מצלמה ב- 20 פריימים s⁻¹ (וידאו משלים S2).

תוצאות

כאן, תולעי דאואר מסוג בר שימשו לתצפיות התנהגות קולקטיביות. תולעים טופחו בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס במשך כ-10-14 ימים וטיפסו עד לפני השטח הפנימיים של מכסה צלחת בינונית DFA. ביום הניסוי, רק המכסה הועבר לצלחת NGM חדשה ללא E. coli ותווך DFA. החלק התחתון של צלחת פטרי זו נשמר בתחילה ב 23 ° C באמצעות מערכ?...

Discussion

במחקר זה אנו מראים פרוטוקול להכנת מערכת להתנהגות קולקטיבית בקנה מידה גדול של C. elegans במעבדה. השיטה מבוססת DFA הוקמה במקור עם Caenorhabditis japonica¹⁴ ו- Neoaplectana carpocapsae Weiser¹⁵, שניהם בעלי חיים שאינם לדוגמה. עם זאת, שיטה זו לא יושמה כדי לחקור התנהגויות קולקטיביות. C. el...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Escherichia coli and C. elegans strains
E. coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center	OP50	Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.
lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP]	author	ZX899	lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing ChR2 and RFP under the control of the mec-4 and unc-122 promoter, respectively
N2 Bristrol	Caenorhabditis Genetics Center		Wild-type C. elegans strain
For worm cultivation
Agar purified, powder	Nakarai tesque	01162-15	For preparation of NGM plates
All-trans retinal	Sigma-Aldrich	R2500	For optogenetics
Bacto pepton	Becton Dickinson	211677	For preparation of NGM plates
Calcium chloride	Wako	036-00485	For preparation of NGM plates
Cholesterol	Wako	034-03002	For preparation of NGM plates
di-Photassium hydrogenphosphate	Nakarai tesque	28727-95	For preparation of NGM plates
Dog food	Nihon Pet Food	VITA-ONE	For preparation of dog food agar medium
LB broth, Lennox	Nakarai tesque	20066-95	For culture of E. coli OP50
Magnesium sulfate anhydrous	TGI	M1890	For preparation of NGM plates
Petri dishes (60 mm)	Nunc	150270	For preparation of NGM plates
Potassium Dihydrogenphosphate	Nakarai tesque	28720-65	For preparation of NGM plates
Sodium Chloride	Nakarai tesque	31320-05	For preparation of NGM plates
Observation
Computer	CT solution	CS6229	Windows10 Pro with Intel Xeon Gold 6238R CPU and 768 GB of RAM
CMOS Camera	Hamamatsu photonics	ORCA-Lightning C14120-20P	For data acquisition
CMOS Camera	Olympus	DP74	For data acquisition
Microscope with SZX-MGFP set	Olympus	MVX10	For data acquisition
x2 Objective lens	Olympus	MV PLAPO 2XC	Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5
Shutter control
Shutter	OptoSigma	BSH2-RIX	For controlling temporal pattern of  light illumination
Shutter controller	OptoSigma	SSH-C2B-A	For controlling temporal pattern of  light illumination
Temperature control
Peltier temperature controller unit	VICS	WLVPU-30	For controlling humidity inside a Petri plate
UNI-THEMO CONTROLLER	Ampere	UTC-100	For controlling humidity inside a Petri plate
Data acquisition software
HCImage	Hamamatsu photonics		For data acquisition