Широкомасштабное культивирование нематод для изучения их коллективного поведения

Резюме

Здесь сообщается о системе изучения коллективного поведения нематод путем их культивирования в больших количествах с использованием пищевой агаровой среды для собак. Эта система позволяет исследователям размножать большое количество червей Дауэра и может быть применена к Caenorhabditis elegans и другим родственным видам.

Аннотация

Животные демонстрируют динамичное коллективное поведение, которое наблюдается в стаях птиц, косяках рыб и толпах людей. Коллективное поведение животных было исследовано как в области биологии, так и в области физики. В лаборатории исследователи использовали различных модельных животных, таких как плодовая муха и рыбка данио, в течение примерно столетия, но изучение крупномасштабного сложного коллективного поведения, организованного этими генетически управляемыми модельными животными, оставалось серьезной проблемой. В данной работе представлен протокол создания экспериментальной системы коллективного поведения у Caenorhabditis elegans. Размножающиеся черви взбираются на крышку пластины Петри и демонстрируют коллективное роение. Система также контролирует взаимодействие и поведение червей, изменяя влажность и световую стимуляцию. Эта система позволяет нам исследовать механизмы, лежащие в основе коллективного поведения, изменяя условия окружающей среды, и изучать влияние локомоции на индивидуальном уровне на коллективное поведение с использованием мутантов. Таким образом, система полезна для будущих исследований как в физике, так и в биологии.

Введение

Как неученые, так и ученые очарованы коллективным поведением животных, например, стаями птиц и косяками рыб. Коллективное поведение было проанализировано в широком спектре областей, включая физику, биологию, математику и робототехнику. В частности, физика активной материи является растущей областью исследований, которая фокусируется на системах, состоящих из самодвижущихся элементов, то есть диссипативных систем, таких как стаи птиц, косяки рыб, биопленки подвижных бактерий, цитоскелеты, состоящие из активных молекул, группы самодвижущихся коллоидов. Теория физики активной материи утверждает, что каким бы сложным ни было поведение индивидуумов, коллективные движения огромного числа живых существ управляются небольшим числом простых правил. Например, модель Вичсека, кандидат на унифицированное описание коллективного движения самодвижущихся частиц, предсказывает, что для формирования дальней упорядоченной фазы с эксцентрическими флуктуациями в 2D, как в стадах^{животных1}, требуется ближнедальнее взаимодействие выравнивания движущихся объектов. Быстрыми темпами развиваются нисходящие экспериментальные подходы к физике активной материи. Предыдущие эксперименты подтвердили образование дальнодействующей упорядоченной фазы у Escherichia^{coli 2}. В других недавних работах использовались клетки ^3,4, бактерии⁵, подвижные коллоиды⁶ или движущиеся белки ^7,8. Простые минимальные модели, такие как модель Вичсека, успешно описывают эти реальные явления. В отличие от этих одноклеточных экспериментальных систем, коллективное поведение животных обычно наблюдается в дикой природе, так как никто не может надеяться провести контролируемые эксперименты с 10 000 реальных птиц или рыб.

Биологи разделяют тот же интерес, что и физики: как люди взаимодействуют друг с другом и функционально ведут себя как группа. Одной из традиционных областей исследований для анализа индивидуального поведения является нейронаука, в которой механизмы, лежащие в основе поведения, изучаются на нейронном и молекулярном уровнях. К настоящему времени было разработано множество нейробиологических подходов, основанных на принципе «снизу вверх». Нисходящий подход в физике и восходящий подход в биологии могут быть реализованы с помощью модельных животных, таких как плодовая мушка, червь Caenorhabditis elegans и мышь⁹. Тем не менее,^{в лаборатории было} получено мало данных о крупномасштабном коллективном поведении этих модельных животных; До сих пор сложно в лабораторных условиях получить генетически поддающихся модельных животных в больших масштабах. Поэтому в современных исследованиях коллективного поведения в биологии и физике ученым, которые обычно проводят исследования в лаборатории, было трудно изучать коллективное поведение животных.

В этом исследовании мы разработали метод крупномасштабного культивирования нематод для изучения их коллективного поведения. Эта система позволяет изменять условия окружающей среды и изучать влияние локомоции на индивидуальном уровне на коллективное поведение с использованием мутантов¹⁰. В физике активной материи параметрами математической модели можно управлять как в экспериментах, так и в симуляциях, что позволяет верифицировать эту модель для выявления унифицированных описаний. Генетика используется для понимания механизма нейронных цепей, лежащих в основе коллективного поведения¹¹.

протокол

1. Заготовка глистов

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте штаммы N2 Bristol¹² и ZX899 дикого типа (lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP])¹³ для наблюдения за коллективным поведением и оптогенетических экспериментов соответственно. Сохраняйте штамм ZX899 в темноте.

1. Поместить четырех хорошо упитанных взрослых червей на 60-миллиметровую пластину, содержащую 14 мл питательной среды нематоды (НГМ) с агаром и засеянную E. coli OP50¹².
2. Выращивайте червей F1 до голодной смерти в планшете NGM при температуре 23 °C в течение 7 дней. Урожайность червей F1 на данный момент составляет примерно 100 червей на пластину. Стадии червей состоят из смешанной популяции личинок L1.

2. Приготовление агара для собак (ДФА) средних тарелок

1. Автоклавируйте стеклянную бутылку, содержащую 2 г порошкообразного корма для собак и 5 мл 1% агаровой среды, и охладите ее до комнатной температуры (рисунок 1А).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте можно использовать другие корма для собак от разных производителей.

3. Посев червей на пластины среды ДФА

1. Перенесите небольшое количество (примерно 0,5 г) среды DFA в центр планшета NGM, засеянного E. coli OP50 (Рисунок 1B). Для оптогенетических экспериментов перед инокуляцией червей наливают 40 мкл 50 мкМ полностью транс-ретиналь, кофактора канального родопсина 2, на ДФА.
2. Соберите истощенных червей с четырех пластин NGM, используя автоклавную воду.
3. Поместите небольшой фрагмент собачьего корма (примерно 0,5 г) на среду DFA на расстоянии примерно 2 мм от крышки тарелки.
4. Осветите пластину NGM ультрафиолетовым светом в течение 15 минут внутри чистого стола, чтобы предотвратить загрязнение.
5. Высейте собранных червей (примерно 400 червей) в среду DFA на планшетах NGM. Не закрывайте планшет парапленкой, чтобы избежать повышения влажности внутри чашки Петри и образования капель воды, которые задерживают червей на крышке.
6. Размножайте червей при температуре 23 °C и дайте им подняться до крышки тарелки примерно 10-14 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку количество червей на крышках почти не увеличивалось через 10-14 дней, предполагалось, что у червей, вероятно, закончилась пища.

4. Наблюдение за коллективным поведением

1. В день эксперимента поместите новую планшет NGM, не содержащую кишечную палочку и агаровую среду для собачьего корма, на алюминиевую пластину на предметном столике микроскопа с макрозумом (рис. 2А). Держите нижнюю часть этой новой пластины NGM при температуре 23 °C с помощью регулятора температуры Пельтье не менее 5 минут (Рисунок 2B). Затем замените крышку этой новой пластины NGM крышкой пластины, на которую забрались черви. Используйте объектив (x2, NA = 0,5) в качестве объектива с малым увеличением (Рисунок 2A).
2. Увеличьте температуру нижней части чашки Петри с 23 °C до 26 °C, чтобы изменить влажность внутри этой чашки (Рисунок 2).
3. Получение изображений внутренней поверхности крышки пластины с помощью камеры на 20 кадрах с⁻¹ (дополнительное видео S1).
4. Сохраните полученные изображения в формате Tagged Image File.

5. Оптогенетический эксперимент

1. Используйте ртутную лампу мощностью 100 Вт для подачи синего света, отфильтрованного с помощью набора фильтров. Точно контролируйте время освещения с помощью электромагнитной системы затворов (рис. 2B).
2. Поддерживайте ZX899 на DFA в этих условиях в течение 5 минут до загорания синего света.
3. Осветите червей ZX899, прикрепленных к крышке планшета Петри на предметном столике микроскопа, поддерживаемом при температуре 23 °C.
4. Получение изображений внутренней поверхности крышки пластины с помощью камеры в режиме 20 кадров с⁻¹ (дополнительное видео S2).

Результаты

Здесь для коллективных наблюдений за поведением использовались черви Дауэра дикого типа. Червей культивировали при температуре 23 °C в течение примерно 10-14 дней и взбирались на внутреннюю поверхность крышки средней пластины DFA. В экспериментальный день только крышку переносили на нову?...

Обсуждение

В данном исследовании мы показываем протокол подготовки системы для крупномасштабного коллективного поведения C. elegans в лабораторных условиях. Метод, основанный на DFA, был первоначально разработан для Caenorhabditis japonica¹⁴ и Neoaplectana carpocapsae Weiser¹⁵, которые н...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Escherichia coli and C. elegans strains
E. coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center	OP50	Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.
lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP]	author	ZX899	lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing ChR2 and RFP under the control of the mec-4 and unc-122 promoter, respectively
N2 Bristrol	Caenorhabditis Genetics Center		Wild-type C. elegans strain
For worm cultivation
Agar purified, powder	Nakarai tesque	01162-15	For preparation of NGM plates
All-trans retinal	Sigma-Aldrich	R2500	For optogenetics
Bacto pepton	Becton Dickinson	211677	For preparation of NGM plates
Calcium chloride	Wako	036-00485	For preparation of NGM plates
Cholesterol	Wako	034-03002	For preparation of NGM plates
di-Photassium hydrogenphosphate	Nakarai tesque	28727-95	For preparation of NGM plates
Dog food	Nihon Pet Food	VITA-ONE	For preparation of dog food agar medium
LB broth, Lennox	Nakarai tesque	20066-95	For culture of E. coli OP50
Magnesium sulfate anhydrous	TGI	M1890	For preparation of NGM plates
Petri dishes (60 mm)	Nunc	150270	For preparation of NGM plates
Potassium Dihydrogenphosphate	Nakarai tesque	28720-65	For preparation of NGM plates
Sodium Chloride	Nakarai tesque	31320-05	For preparation of NGM plates
Observation
Computer	CT solution	CS6229	Windows10 Pro with Intel Xeon Gold 6238R CPU and 768 GB of RAM
CMOS Camera	Hamamatsu photonics	ORCA-Lightning C14120-20P	For data acquisition
CMOS Camera	Olympus	DP74	For data acquisition
Microscope with SZX-MGFP set	Olympus	MVX10	For data acquisition
x2 Objective lens	Olympus	MV PLAPO 2XC	Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5
Shutter control
Shutter	OptoSigma	BSH2-RIX	For controlling temporal pattern of  light illumination
Shutter controller	OptoSigma	SSH-C2B-A	For controlling temporal pattern of  light illumination
Temperature control
Peltier temperature controller unit	VICS	WLVPU-30	For controlling humidity inside a Petri plate
UNI-THEMO CONTROLLER	Ampere	UTC-100	For controlling humidity inside a Petri plate
Data acquisition software
HCImage	Hamamatsu photonics		For data acquisition