La coltivazione su larga scala dei nematodi per studiarne i comportamenti collettivi

Riepilogo

Qui, viene riportato un sistema per studiare i comportamenti collettivi dei nematodi coltivandoli alla rinfusa utilizzando un terreno di agar per cibo per cani. Questo sistema consente ai ricercatori di propagare un gran numero di vermi dauer e può essere applicato a Caenorhabditis elegans e ad altre specie correlate.

Abstract

Gli animali mostrano comportamenti collettivi dinamici, come osservato in stormi di uccelli, banchi di pesci e folle di esseri umani. I comportamenti collettivi degli animali sono stati studiati sia nel campo della biologia che in quello della fisica. In laboratorio, i ricercatori hanno utilizzato vari animali modello come il moscerino della frutta e il pesce zebra per circa un secolo, ma è rimasta una grande sfida studiare il comportamento collettivo complesso su larga scala orchestrato da questi animali modello geneticamente trattabili. Questo articolo presenta un protocollo per creare un sistema sperimentale di comportamenti collettivi in Caenorhabditis elegans. I vermi propagati si arrampicano sul coperchio della piastra di Petri e mostrano un comportamento di sciamatura collettiva. Il sistema controlla anche le interazioni e i comportamenti dei vermi modificando l'umidità e la stimolazione della luce. Questo sistema ci permette di esaminare i meccanismi alla base dei comportamenti collettivi modificando le condizioni ambientali ed esaminando gli effetti della locomozione a livello individuale sui comportamenti collettivi che utilizzano i mutanti. Pertanto, il sistema è utile per la ricerca futura sia in fisica che in biologia.

Introduzione

Sia i non scienziati che gli scienziati sono affascinati dai comportamenti collettivi degli animali, come negli stormi di uccelli e nei banchi di pesci. I comportamenti collettivi sono stati analizzati in una vasta gamma di campi, tra cui la fisica, la biologia, la matematica e la robotica. In particolare, la fisica della materia attiva è un campo di ricerca in crescita che si concentra su sistemi composti da elementi semoventi, cioè sistemi dissipativi, come stormi di uccelli, banchi di pesci, biofilm di batteri mobili, citoscheletri composti da molecole attive e gruppi di colloidi semoventi. La teoria della fisica della materia attiva sostiene che, per quanto complessi siano i comportamenti degli individui, i moti collettivi di un numero enorme di esseri viventi sono governati da un piccolo numero di semplici regole. Ad esempio, il modello di Vicsek, un candidato per una descrizione unificata del moto collettivo delle particelle semoventi, prevede che l'interazione di allineamento a corto raggio di oggetti in movimento sia necessaria per formare una fase ordinata a lungo raggio con fluttuazione eccentrica in 2D, come nei branchi di animali¹. Gli approcci sperimentali top-down relativi alla fisica della materia attiva si stanno sviluppando rapidamente. Esperimenti precedenti hanno confermato la formazione di una fase ordinata a lungo raggio in Escherichia coli². Altri lavori recenti hanno impiegato cellule ^3,4, batteri⁵, colloidi mobili⁶ o proteine in movimento ^7,8. Semplici modelli minimali come il modello di Vicsek hanno descritto con successo questi fenomeni reali. In contrasto con questi sistemi sperimentali unicellulari, i comportamenti collettivi degli animali sono solitamente osservati in natura, poiché nessuno potrebbe sperare di eseguire esperimenti controllati con 10.000 uccelli o pesci reali.

I biologi condividono lo stesso interesse dei fisici: come gli individui interagiscono tra loro e si comportano funzionalmente come un gruppo. Uno dei campi di ricerca tradizionali per l'analisi del comportamento individuale sono le neuroscienze, in cui i meccanismi alla base del comportamento sono stati esaminati a livello neuronale e molecolare. Finora sono stati sviluppati molti approcci neuroscientifici bottom-up. Gli approcci dall'alto verso il basso in fisica e gli approcci dal basso verso l'alto in biologia possono essere facilitati utilizzando animali modello come il moscerino della frutta, il verme Caenorhabditis elegans e il topo⁹. Tuttavia, ci sono stati pochi risultati sul comportamento collettivo su larga scala di questi animali modello in laboratorio¹⁰; È ancora difficile preparare in laboratorio modelli di animali geneticamente trattabili su larga scala. Pertanto, nell'attuale ricerca sui comportamenti collettivi in biologia e fisica, è stato difficile per gli scienziati che di solito fanno ricerca in laboratorio studiare i comportamenti collettivi degli animali.

In questo studio, abbiamo stabilito un metodo per la coltivazione su larga scala dei nematodi per studiare i loro comportamenti collettivi. Questo sistema ci permette di modificare le condizioni ambientali ed esaminare l'effetto della locomozione a livello individuale sui comportamenti collettivi utilizzando mutanti¹⁰. Nella fisica della materia attiva, i parametri del modello matematico possono essere controllati sia negli esperimenti che nelle simulazioni, il che consente la verifica di tale modello per identificare descrizioni unificate. La genetica viene utilizzata per comprendere il meccanismo del circuito neurale alla base del comportamento collettivo¹¹.

Protocollo

1. Preparazione dei vermi

NOTA: Preparare il ceppo wild-type N2 Bristol¹² e il ceppo ZX899 (lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP])¹³ per l'osservazione dei comportamenti collettivi e degli esperimenti optogenici, rispettivamente. Mantenere la varietà ZX899 in condizioni di oscurità.

1. Depositare quattro vermi adulti ben nutriti su una piastra di 60 mm contenente 14 mL di terreno di coltura per nematodi (NGM) con agar e seminati con E. coli OP50¹².
2. Far crescere i vermi F1 fino a farli morire di fame nella piastra NGM a 23 °C per 7 giorni. A questo punto, la resa dei vermi F1 è di circa 100 viti senza fine/piastra. Gli stadi dei vermi comprendono una popolazione mista di larve di dauer e larve di L1 affamate.

2. Preparazione di piatti medi di agar per cani (DFA)

1. Autoclavare un flacone di vetro contenente 2 g di cibo per cani in polvere e 5 ml di terreno agar all'1% e raffreddarlo a temperatura ambiente (Figura 1A).
   NOTA: In questo esperimento possono essere utilizzati altri alimenti per cani di diversi produttori.

3. Inoculazione di vermi su piastre medie DFA

1. Trasferire piccole quantità (circa 0,5 g) di terreno DFA al centro di una piastra NGM seminata con E. coli OP50 (Figura 1B). Per gli esperimenti optogenici, versare 40 μL di 50 μM all-trans-retinale, il cofattore del canale rodopsina 2, sul DFA prima dell'inoculazione dei vermi.
2. Raccogli i vermi affamati da quattro piastre NGM usando acqua sterilizzata in autoclave.
3. Posizionare un piccolo frammento di cibo per cani (circa 0.5 g) sul terreno DFA, a circa 2 mm di distanza dal coperchio del piatto.
4. Illuminare la piastra NGM con luce ultravioletta per 15 minuti all'interno di un banco pulito per evitare contaminazioni.
5. Inoculare i vermi raccolti (circa 400 vermi) sul terreno DFA su piastre NGM. Non sigillare la piastra con parafilm per evitare di aumentare l'umidità all'interno della piastra di Petri e generare goccioline d'acqua che intrappolano i vermi su un coperchio.
6. Propagare i vermi a 23 °C e lasciarli salire fino al coperchio della piastra per circa 10-14 giorni.
   NOTA: Poiché il numero di vermi sui coperchi non aumentava quasi mai dopo 10-14 giorni, si presumeva che i vermi avessero probabilmente esaurito il cibo.

4. Osservazione del comportamento collettivo

1. Il giorno dell'esperimento, posizionare una nuova piastra NGM che non includeva E. coli e terreno agar per cibo per cani su una piastra di alluminio sul tavolino di un microscopio macro zoom (Figura 2A). Mantenere la parte inferiore di questa nuova piastra NGM a 23 °C utilizzando un'unità di controllo della temperatura Peltier per almeno 5 minuti (Figura 2B). Quindi, sostituisci il coperchio di questa nuova piastra NGM con il coperchio della piastra su cui si sono arrampicati i vermi. Utilizzare la lente dell'obiettivo (x2, NA = 0,5) come obiettivo a basso ingrandimento (Figura 2A).
2. Aumentare la temperatura del fondo della piastra di Petri da 23 °C a 26 °C per modificare l'umidità all'interno della piastra (Figura 2).
3. Acquisire immagini della superficie interna del coperchio della piastra con la fotocamera a 20 fotogrammi s⁻¹ (video supplementare S1).
4. Salvare le immagini acquisite nel formato File immagine con tag.

5. Esperimento optogenetico

1. Usa una lampada al mercurio da 100 W per fornire luce blu, filtrata con un set di filtri. Controllare con precisione il tempo di illuminazione utilizzando un sistema di otturatori elettromagnetici (Figura 2B).
2. Mantenere lo ZX899 su DFA in queste condizioni per 5 minuti prima dell'accensione a luce blu.
3. Illuminare i vermi ZX899 attaccati al coperchio di una piastra di Petri sul tavolino del microscopio mantenuto a 23 °C.
4. Acquisire immagini della superficie interna del coperchio della piastra con una telecamera a 20 fotogrammi s⁻¹ (video supplementare S2).

Risultati

Qui, i vermi dauer wild-type sono stati utilizzati per le osservazioni collettive del comportamento. I vermi sono stati coltivati a 23 °C per circa 10-14 giorni e si sono arrampicati fino alla superficie interna del coperchio di una piastra media DFA. Il giorno dell'esperimento, solo il coperchio è stato trasferito su una nuova piastra NGM senza terreno di E. coli e DFA. Il fondo di questa piastra di Petri è stato inizialmente mantenuto a 23 °C utilizzando il sistema di Peltier, quindi la sua temperatura è ...

Discussione

In questo studio, mostriamo un protocollo per la preparazione di un sistema per il comportamento collettivo su larga scala di C. elegans in laboratorio. Il metodo basato sul DFA è stato originariamente stabilito con Caenorhabditis japonica¹⁴ e Neoaplectana carpocapsae Weiser¹⁵, entrambi animali non modello. Tuttavia, questo metodo non è stato applicato per indagare i comportamenti collettivi. Il C. elegans è un animale modello genetica...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Escherichia coli and C. elegans strains
E. coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center	OP50	Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.
lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP]	author	ZX899	lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing ChR2 and RFP under the control of the mec-4 and unc-122 promoter, respectively
N2 Bristrol	Caenorhabditis Genetics Center		Wild-type C. elegans strain
For worm cultivation
Agar purified, powder	Nakarai tesque	01162-15	For preparation of NGM plates
All-trans retinal	Sigma-Aldrich	R2500	For optogenetics
Bacto pepton	Becton Dickinson	211677	For preparation of NGM plates
Calcium chloride	Wako	036-00485	For preparation of NGM plates
Cholesterol	Wako	034-03002	For preparation of NGM plates
di-Photassium hydrogenphosphate	Nakarai tesque	28727-95	For preparation of NGM plates
Dog food	Nihon Pet Food	VITA-ONE	For preparation of dog food agar medium
LB broth, Lennox	Nakarai tesque	20066-95	For culture of E. coli OP50
Magnesium sulfate anhydrous	TGI	M1890	For preparation of NGM plates
Petri dishes (60 mm)	Nunc	150270	For preparation of NGM plates
Potassium Dihydrogenphosphate	Nakarai tesque	28720-65	For preparation of NGM plates
Sodium Chloride	Nakarai tesque	31320-05	For preparation of NGM plates
Observation
Computer	CT solution	CS6229	Windows10 Pro with Intel Xeon Gold 6238R CPU and 768 GB of RAM
CMOS Camera	Hamamatsu photonics	ORCA-Lightning C14120-20P	For data acquisition
CMOS Camera	Olympus	DP74	For data acquisition
Microscope with SZX-MGFP set	Olympus	MVX10	For data acquisition
x2 Objective lens	Olympus	MV PLAPO 2XC	Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5
Shutter control
Shutter	OptoSigma	BSH2-RIX	For controlling temporal pattern of  light illumination
Shutter controller	OptoSigma	SSH-C2B-A	For controlling temporal pattern of  light illumination
Temperature control
Peltier temperature controller unit	VICS	WLVPU-30	For controlling humidity inside a Petri plate
UNI-THEMO CONTROLLER	Ampere	UTC-100	For controlling humidity inside a Petri plate
Data acquisition software
HCImage	Hamamatsu photonics		For data acquisition