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요약

여기에서는 개 사료 한천 배지를 사용하여 선충을 대량으로 배양하여 선충의 집단 행동을 연구하는 시스템이보고되었습니다. 이 시스템을 통해 연구자들은 많은 수의 다우어 웜을 번식시킬 수 있으며 Caenorhabditis elegans 및 기타 관련 종에 적용할 수 있습니다.

초록

동물은 새 떼, 물고기 떼, 인간 무리에서 관찰되는 것처럼 역동적인 집단 행동을 나타냅니다. 동물의 집단 행동은 생물학과 물리학 분야에서 조사되었습니다. 실험실에서 연구자들은 약 100년 동안 초파리와 제브라피시와 같은 다양한 모델 동물을 사용해 왔지만, 유전적으로 다루기 쉬운 모델 동물에 의해 조정된 대규모의 복잡한 집단 행동을 연구하는 것은 여전히 주요 과제로 남아 있습니다. 이 논문은 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)의 집단 행동에 대한 실험적 시스템을 만들기 위한 프로토콜을 제시합니다. 번식된 벌레는 페트리 판의 뚜껑에 올라가 집단 떼 행동을 보입니다. 이 시스템은 또한 습도와 빛 자극을 변경하여 벌레의 상호 작용과 행동을 제어합니다. 이 시스템을 통해 우리는 환경 조건을 변화시키고 돌연변이를 사용하여 집단 행동에 대한 개인 수준의 운동이 집단 행동에 미치는 영향을 조사함으로써 집단 행동의 기저에 있는 메커니즘을 조사할 수 있습니다. 따라서 이 시스템은 물리학과 생물학 모두에서 향후 연구에 유용합니다.

서문

비과학자와 과학자 모두 새 떼와 물고기 떼와 같은 동물의 집단 행동에 매료되어 있습니다. 집단 행동은 물리학, 생물학, 수학 및 로봇 공학을 포함한 광범위한 분야에서 분석되었습니다. 특히, 활성물질 물리학은 조류 떼, 물고기 떼, 운동성 박테리아의 생물막, 활성 분자로 구성된 세포골격, 자체 추진 콜로이드 그룹과 같은 자체 추진 원소로 구성된 시스템, 즉 소산 시스템에 중점을 둔 연구 분야입니다. 활성 물질 물리학 이론은 개인의 행동이 아무리 복잡하더라도 엄청난 수의 생물의 집단 운동은 소수의 간단한 규칙에 의해 지배된다고 주장합니다. 예를 들어, 자체 추진 입자의 집단 운동에 대한 통일된 설명의 후보인 Vicsek 모델은 동물 무리에서와 같이 2D에서 편심 변동이 있는 장거리 정렬 위상을 형성하기 위해 움직이는 물체의 단거리 정렬 상호 작용이 필요하다고 예측합니다1. 활성 물질의 물리학과 관련된 하향식 실험적 접근 방식이 빠르게 발전하고 있습니다. 이전 실험에서는 대장균2에서 장거리 주문상의 형성을 확인했습니다. 최근의 다른 연구에서는 세포 3,4, 박테리아5, 운동성 콜로이드6 또는 움직이는 단백질 7,8을 사용했다. Vicsek 모델과 같은 간단한 최소 모델은 이러한 실제 현상을 성공적으로 설명했습니다. 이러한 단세포 실험 시스템과는 대조적으로, 동물의 집단 행동은 일반적으로 야생에서 관찰되는데, 아무도 10,000마리의 실제 새나 물고기를 대상으로 통제된 실험을 수행하기를 바랄 수 없기 때문입니다.

생물학자들은 물리학자들과 같은 관심사를 가지고 있습니다: 개인이 어떻게 서로 상호 작용하고 기능적으로 그룹으로서 행동하는지. 개인의 행동을 분석하기 위한 전통적인 연구 분야 중 하나는 신경 과학으로, 행동의 기저에 있는 메커니즘을 신경 및 분자 수준에서 조사했습니다. 지금까지 많은 신경과학적 상향식 접근법이 개발되었다. 물리학의 하향식 접근법과 생물학의 상향식 접근법은 초파리, 예 쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans) 및 생쥐(mouse)와 같은 모델 동물을 사용하여 촉진될 수 있다9. 그러나, 실험실에서 이들 모델 동물의 대규모 집단 행동에 대한 발견은 거의 없었다10; 실험실에서 유전적으로 다루기 쉬운 모델 동물을 대규모로 준비하는 것은 여전히 어렵습니다. 따라서 현재 생물학과 물리학의 집단행동에 대한 연구에서 일반적으로 실험실에서 연구를 수행하는 과학자들은 동물의 집단행동을 연구하는 것이 어려웠다.

이 연구에서는 선충의 집단 행동을 연구하기 위해 선충을 대규모로 배양하는 방법을 확립했습니다. 이 시스템을 통해 우리는 환경 조건을 변화시키고 돌연변이10을 사용하여 집단 행동에 대한 개인 수준의 운동이 미치는 영향을 조사할 수 있습니다. 활성 물질 물리학에서 수학적 모델의 매개변수는 실험과 시뮬레이션 모두에서 제어할 수 있으며, 이를 통해 통일된 설명을 식별하기 위해 해당 모델을 검증할 수 있습니다. 유전학은 집단 행동의 기저에 있는 신경 회로 메커니즘을 이해하는 데 사용된다11.

프로토콜

1. 웜의 준비

참고: 집단 행동 및 광유전학 실험의 관찰을 위해 야생형 N2 브리스톨 균주12 및 ZX899 균주(lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP])13 을 각각 준비합니다. 어두운 조건에서 ZX899 변형을 유지하십시오.

  1. 14mL의 선충 성장 배지(NGM)가 포함된 60mm 플레이트에 잘 먹은 성충 4마리를 한천과 함께 넣고 대장균 OP5012를 뿌립니다.
  2. F1 웜을 23°C의 NGM 플레이트에서 7일 동안 굶어 죽입니다. 이 시점에서 F1 웜의 수율은 약 100개의 웜/플레이트입니다. 벌레의 단계는 다우어와 굶주린 L1 유충의 혼합 개체군으로 구성됩니다.

2. 개 사료 한천(DFA) 미디엄 플레이트 준비

  1. 분말 개 사료 2g과 1% 한천 배지 5mL가 들어 있는 유리병을 고압멸균하고 실온으로 냉각합니다(그림 1A).
    알림: 이 실험에는 다른 제조업체의 다른 개 사료를 사용할 수 있습니다.

3. DFA 중간 판에 벌레 접종

  1. 소량(약 0.5g)의 DFA 배지를 대장균 OP50으로 파종한 NGM 플레이트의 중앙으로 옮깁니다(그림 1B). 광유전학 실험의 경우 웜을 접종하기 전에 채널 로돕신 2의 보조 인자인 50μM all-trans-retinal 40μL를 DFA에 붓습니다.
  2. 고압멸균수를 사용하여 4개의 NGM 플레이트에서 굶주린 벌레를 수집합니다.
  3. 접시 뚜껑에서 약 0.5mm 떨어진 DFA 매체에 작은 개 사료 조각(약 2g)을 놓습니다.
  4. 오염을 방지하기 위해 깨끗한 벤치 내부에서 15분 동안 자외선으로 NGM 플레이트를 비춥니다.
  5. 수집된 웜(약 400마리)을 NGM 플레이트의 DFA 배지에 접종합니다. 페트리 플레이트 내부의 습도가 증가하고 뚜껑에 벌레를 가두는 물방울이 생성되는 것을 방지하기 위해 파라필름으로 플레이트를 밀봉하지 마십시오.
  6. 23 °C에서 웜을 번식시키고 약 10-14 일 동안 접시 뚜껑까지 올라갈 수 있도록합니다.
    알림: 뚜껑에 있는 벌레의 수는 10-14일 후에도 거의 증가하지 않았기 때문에 벌레의 먹이가 떨어졌을 가능성이 있는 것으로 추정되었습니다.

4. 집단 행동의 관찰

  1. 실험 당일, 대장균 과 개 사료 한천 배지를 포함하지 않은 새 NGM 플레이트를 매크로 줌 현미경 스테이지의 알루미늄 플레이트에 놓습니다(그림 2A). Peltier 온도 조절기 장치를 사용하여 이 새로운 NGM 플레이트의 바닥을 23°C에서 최소 5분 동안 유지합니다(그림 2B). 그런 다음 이 새 NGM 플레이트의 뚜껑을 웜이 올라간 플레이트의 뚜껑으로 교체합니다. 대물 렌즈(x2, NA = 0.5)를 저배율 대물렌즈로 사용합니다(그림 2A).
  2. Petri 플레이트 바닥의 온도를 23°C에서 26°C로 높여 플레이트 내부의 습도를 변경합니다(그림 2).
  3. 카메라를 사용하여 20 프레임 s−1 (보충 비디오 S1)에서 플레이트 덮개 내부 표면의 이미지를 획득합니다.
  4. 획득한 이미지를 태그가 지정된 이미지 파일 형식으로 저장합니다.

5. 광유전학 실험

  1. 100W 수은 램프를 사용하여 필터 세트로 필터링된 청색광을 전달합니다. 전자기 셔터 시스템을 사용하여 조명 시간을 정밀하게 제어합니다(그림 2B).
  2. 청색광 조명 전에 이러한 조건에서 ZX899를 DFA에서 5분 동안 유지하십시오.
  3. 현미경 s에서 페트리 플레이트의 뚜껑에 부착된 ZX899 웜을 비춥니다.tage 23°C로 유지됩니다.
  4. 20 프레임 s−1 에서 카메라로 플레이트 뚜껑 내부 표면의 이미지를 획득합니다(보충 비디오 S2).

결과

여기에서 야생형 다우어 웜은 집단 행동 관찰에 사용되었습니다. 웜을 23°C에서 약 10-14일 동안 배양하고 DFA 배지 플레이트의 뚜껑 내부 표면까지 올라갔습니다. 실험 당일에는 뚜껑만 대장균 및 DFA 배지가 없는 새로운 NGM 플레이트로 옮겼습니다. 이 페트리 플레이트의 바닥은 처음에 펠티에 시스템을 사용하여 23°C로 유지한 다음 온도를 26°C로 높였습니다. 현미경으로 동영상을 찍었습니?...

토론

이 연구에서는 실험실에서 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 대규모 집단 행동을 위한 시스템을 준비하기 위한 프로토콜을 보여줍니다. DFA 기반 방법은 원래 Caenorhabditis japonica14 및 Neoaplectana carpocapsae Weiser15로 확립되었으며, 둘 다 비모델 동물입니다. 그러나 이 방법은 집단 행동을 조사하는 데 적용되지 않았습니다. 예쁜꼬마선충(C. elegans)은 ...

공개

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

이 연구에 사용된 균주를 제공한 Caenorhabditis Genetics Center에 감사드립니다. 이 간행물은 JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (보조금 번호 JP21H02532), JSPS KAKENHI Grant-in-Aid on the Innovative Areas "Science of Soft Robot" 프로젝트(보조금 번호 JP18H05474), JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Transformative Research Areas B(보조금 번호 JP23H03845), 일본 의료연구개발기구의 PRIME(보조금 번호 JP22gm6110022h9904), JST-Mirai 프로그램(보조금 번호 JPMJMI22G3)의 지원을 받았습니다. 및 JST-FOREST 프로그램(보조금 번호 JPMJFR214R).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Escherichia coli and C. elegans strains
E. coli OP50Caenorhabditis Genetics CenterOP50Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.
lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP]authorZX899lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing ChR2 and RFP under the control of the mec-4 and unc-122 promoter, respectively
N2 BristrolCaenorhabditis Genetics CenterWild-type C. elegans strain
For worm cultivation
Agar purified, powderNakarai tesque01162-15For preparation of NGM plates
All-trans retinalSigma-AldrichR2500For optogenetics
Bacto peptonBecton Dickinson211677For preparation of NGM plates
Calcium chlorideWako036-00485For preparation of NGM plates
CholesterolWako034-03002For preparation of NGM plates
di-Photassium hydrogenphosphateNakarai tesque28727-95For preparation of NGM plates
Dog foodNihon Pet FoodVITA-ONEFor preparation of dog food agar medium
LB broth, LennoxNakarai tesque20066-95For culture of E. coli OP50
Magnesium sulfate anhydrousTGIM1890For preparation of NGM plates
Petri dishes (60 mm)Nunc150270For preparation of NGM plates
Potassium DihydrogenphosphateNakarai tesque28720-65For preparation of NGM plates
Sodium ChlorideNakarai tesque31320-05For preparation of NGM plates
Observation
ComputerCT solutionCS6229Windows10 Pro with Intel Xeon Gold 6238R CPU and 768 GB of RAM
CMOS CameraHamamatsu photonics ORCA-Lightning C14120-20PFor data acquisition
CMOS CameraOlympusDP74For data acquisition
Microscope with SZX-MGFP setOlympusMVX10For data acquisition
x2 Objective lensOlympusMV PLAPO 2XCWorking distance 20 mm and numerical aperture 0.5
Shutter control
ShutterOptoSigmaBSH2-RIXFor controlling temporal pattern of  light illumination
Shutter controllerOptoSigmaSSH-C2B-AFor controlling temporal pattern of  light illumination
Temperature control
Peltier temperature controller unitVICSWLVPU-30For controlling humidity inside a Petri plate
UNI-THEMO CONTROLLERAmpereUTC-100For controlling humidity inside a Petri plate
Data acquisition software
HCImageHamamatsu photonicsFor data acquisition

참고문헌

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