大规模培养线虫以研究其集体行为

摘要

在这里，报道了一种通过使用狗粮琼脂培养基大量培养线虫来研究线虫集体行为的系统。该系统允许研究人员繁殖大量的dauer蠕虫，并可应用于 秀丽隐杆线虫 和其他相关物种。

摘要

动物表现出动态的集体行为，如在成群的鸟类、鱼群和成群的人类中观察到的那样。动物的集体行为已经在生物学和物理学领域进行了研究。在实验室中，研究人员使用各种模式动物（如果蝇和斑马鱼）大约一个世纪，但研究这些基因可处理的模式动物精心策划的大规模复杂集体行为仍然是一个重大挑战。本文提出了一种在 秀丽隐杆线虫中创建集体行为实验系统的协议。繁殖的蠕虫爬上培养皿的盖子，并表现出集体蜂拥行为。该系统还通过改变湿度和光刺激来控制蠕虫的相互作用和行为。该系统使我们能够通过改变环境条件和使用突变体检查个体水平运动对集体行为的影响来检查集体行为背后的机制。因此，该系统对物理学和生物学的未来研究都很有用。

引言

非科学家和科学家都对动物的集体行为着迷，比如成群的鸟和鱼群。集体行为已经在广泛的领域进行了分析，包括物理学、生物学、数学和机器人技术。特别是，活性物质物理学是一个不断发展的研究领域，专注于由自走式元素组成的系统，即耗散系统，如鸟群、鱼群、运动细菌的生物膜、活性分子组成的细胞骨架和自走胶体组。活性物质物理学理论认为，无论个体的行为多么复杂，大量生物的集体运动都受到少数简单规则的支配。例如，Vicsek模型是统一描述自走式粒子集体运动的候选者，它预测运动物体的短程对准相互作用需要形成具有二维偏心波动的长程有序相位，就像在动物群^中一样1。与活性物质物理学有关的自上而下的实验方法正在迅速发展。先前的实验证实了大肠杆菌²中长程有序相的形成。最近的其他工作使用了细胞^3,4，细菌⁵，运动胶体⁶或移动蛋白质^7,8。简单的最小模型（如Vicsek模型）成功地描述了这些真实现象。与这些单细胞实验系统相比，动物的集体行为通常是在野外观察到的，因为没有人希望对10,000只真正的鸟类或鱼类进行对照实验。

生物学家与物理学家有着相同的兴趣：个体如何相互影响，如何作为一个群体在功能上表现。分析个体行为的传统研究领域之一是神经科学，其中行为背后的机制已经在神经元和分子水平上进行了研究。到目前为止，已经开发了许多神经科学自下而上的方法。物理学中的自上而下方法和生物学中的自下而上方法可以使用模式动物（如果蝇、 蠕虫秀丽隐杆线虫和小鼠^{）来促进 9}.然而，在实验室中，关于这些模式动物的大规模集体行为的发现很少¹⁰;在实验室中大规模制备遗传上可处理的模式动物仍然很困难。因此，在目前生物学和物理学中对集体行为的研究中，通常在实验室进行研究的科学家很难研究动物的集体行为。

在这项研究中，我们建立了一种大规模培养线虫的方法，以研究它们的集体行为。该系统使我们能够改变环境条件，并使用突变体¹⁰ 检查个体水平运动对集体行为的影响。在活性物质物理学中，数学模型的参数可以在实验和模拟中控制，从而可以验证该模型以识别统一描述。遗传学用于理解集体行为背后的神经回路机制¹¹.

研究方案

1.蠕虫的制备

注：制备野生型N2布里斯托尔菌株¹² 和ZX899菌株（lite-1（ce314）;ljIs123[mec-4p：：ChR2，unc-122p：：RFP]）¹³ 分别用于观察集体行为和光遗传学实验。在黑暗条件下保持 ZX899 菌株。

1. 将四条喂养良好的成虫沉积在含有14mL线虫生长培养基（NGM）的60mm板上，并接种大 肠杆菌 OP50¹²。
2. 在23°C的NGM板中将F1蠕虫培养至饥饿7天。此时，F1 蜗杆的产量约为 100 只蜗杆/板。蠕虫的各个阶段包括 dauer 和饥饿的 L1 幼虫的混合种群。

2.狗粮琼脂（DFA）培养基板的制备

1. 高压灭菌含有2g狗粮粉和5mL 1%琼脂培养基的玻璃瓶，并将其冷却至室温（图1A）。
   注意：本实验可以使用来自不同制造商的其他狗粮。

3. 将蠕虫接种到 DFA 培养基板上

1. 将少量（约0.5g）DFA培养基转移到接种有 大肠杆 菌OP50的NGM板的中心（图1B）。对于光遗传学实验，在接种蠕虫之前，将 40 μL 50 μM 全反式视网膜醛（通道视紫红质 2 的辅助因子）倒入 DFA 上。
2. 使用高压灭菌水从四个NGM板中收集饥饿的蠕虫。
3. 将一小块狗粮（约0.5g）放在DFA培养基上，距离板盖约2mm。
4. 在洁净的工作台内用紫外线照射 NGM 板 15 分钟，以防止污染。
5. 将收集的蠕虫（约400条蠕虫）接种到NGM板上的DFA培养基上。不要用封口膜密封板，以免增加培养皿内的湿度并产生水滴，将蠕虫困在盖子上。
6. 在23°C下繁殖蠕虫，并让它们爬到板盖上约10-14天。
   注意：由于盖子上的蠕虫数量在 10-14 天后几乎没有增加，因此推测蠕虫可能已经耗尽了食物。

4. 集体行为的观察

1. 在实验当天，将不包括 大肠杆菌 和狗粮琼脂培养基的新NGM板放在微距变焦显微镜载物台上的铝板上（图2A）。使用Peltier温度控制器将这种新的NGM板的底部保持在23°C至少5分钟（图2B）。然后，将这个新的NGM板的盖子换成蠕虫爬上去的板盖。使用物镜（x2，NA = 0.5）作为低倍率物镜（图2A）。
2. 将培养皿底部的温度从23°C提高到26°C，以改变该板内的湿度（图2）。
3. 使用相机以 20 帧 ^s-1 采集板盖内表面的图像（补充视频 S1）。
4. 将采集的图像保存为标记图像文件格式。

5. 光遗传学实验

1. 使用 100 W 汞灯提供蓝光，并用滤光片组过滤。使用电磁快门系统精确控制照明时间（图2B）。
2. 在这些条件下将 ZX899 在 DFA 上保持 5 分钟，然后再亮起蓝光。
3. 在保持在23°C的显微镜载物台上照亮附着在培养皿盖上的ZX899蠕虫。
4. 使用相机以 20 帧 ^s-1 采集板盖内表面的图像（补充视频 S2）。

结果

在这里，野生型dauer蠕虫被用于集体行为观察。将蠕虫在23°C下培养约10-14天，并爬到DFA培养基板盖的内表面。在实验当天，仅将盖子转移到没有 大肠杆菌 和DFA培养基的新NGM板上。该培养皿的底部最初使用帕尔贴系统保持在23°C，然后将其温度提高到26°C。 在显微镜下拍摄了一部电影。 图 3 显示了影片的快照。蠕虫在湿度变化期间动态重塑了它们的网络模式。随着湿?...

讨论

在这项研究中，我们展示了一种在实验室中为秀丽隐杆线虫的大规模集体行为准备系统的方案。基于DFA的方法最初是用Caenorhabditis japonica¹⁴和Neoaplectana carpocapsae Weiser¹⁵建立的，两者都是非模式动物。然而，这种方法并未应用于调查集体行为。秀丽隐杆线虫是一种遗传上可处理的模式动物^11,12?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Escherichia coli and C. elegans strains
E. coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center	OP50	Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.
lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP]	author	ZX899	lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing ChR2 and RFP under the control of the mec-4 and unc-122 promoter, respectively
N2 Bristrol	Caenorhabditis Genetics Center		Wild-type C. elegans strain
For worm cultivation
Agar purified, powder	Nakarai tesque	01162-15	For preparation of NGM plates
All-trans retinal	Sigma-Aldrich	R2500	For optogenetics
Bacto pepton	Becton Dickinson	211677	For preparation of NGM plates
Calcium chloride	Wako	036-00485	For preparation of NGM plates
Cholesterol	Wako	034-03002	For preparation of NGM plates
di-Photassium hydrogenphosphate	Nakarai tesque	28727-95	For preparation of NGM plates
Dog food	Nihon Pet Food	VITA-ONE	For preparation of dog food agar medium
LB broth, Lennox	Nakarai tesque	20066-95	For culture of E. coli OP50
Magnesium sulfate anhydrous	TGI	M1890	For preparation of NGM plates
Petri dishes (60 mm)	Nunc	150270	For preparation of NGM plates
Potassium Dihydrogenphosphate	Nakarai tesque	28720-65	For preparation of NGM plates
Sodium Chloride	Nakarai tesque	31320-05	For preparation of NGM plates
Observation
Computer	CT solution	CS6229	Windows10 Pro with Intel Xeon Gold 6238R CPU and 768 GB of RAM
CMOS Camera	Hamamatsu photonics	ORCA-Lightning C14120-20P	For data acquisition
CMOS Camera	Olympus	DP74	For data acquisition
Microscope with SZX-MGFP set	Olympus	MVX10	For data acquisition
x2 Objective lens	Olympus	MV PLAPO 2XC	Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5
Shutter control
Shutter	OptoSigma	BSH2-RIX	For controlling temporal pattern of  light illumination
Shutter controller	OptoSigma	SSH-C2B-A	For controlling temporal pattern of  light illumination
Temperature control
Peltier temperature controller unit	VICS	WLVPU-30	For controlling humidity inside a Petri plate
UNI-THEMO CONTROLLER	Ampere	UTC-100	For controlling humidity inside a Petri plate
Data acquisition software
HCImage	Hamamatsu photonics		For data acquisition