Die großflächige Kultivierung von Nematoden, um ihr kollektives Verhalten zu untersuchen

Zusammenfassung

Hier wird über ein System zur Untersuchung des kollektiven Verhaltens von Nematoden berichtet, indem sie in großen Mengen mit Hundefutter-Agar-Medium kultiviert werden. Dieses System ermöglicht es Forschern, eine große Anzahl von Dauerwürmern zu vermehren und kann auf Caenorhabditis elegans und andere verwandte Arten angewendet werden.

Zusammenfassung

Tiere zeigen dynamische kollektive Verhaltensweisen, wie sie in Vogelschwärmen, Fischschwärmen und Menschenmassen beobachtet werden. Das kollektive Verhalten von Tieren wurde sowohl in der Biologie als auch in der Physik untersucht. Im Labor verwenden die Forscher seit etwa einem Jahrhundert verschiedene Modelltiere wie die Fruchtfliege und den Zebrafisch, aber es ist nach wie vor eine große Herausforderung, das komplexe kollektive Verhalten dieser genetisch manipulierbaren Modelltiere zu untersuchen. In diesem Artikel wird ein Protokoll vorgestellt, um ein experimentelles System kollektiver Verhaltensweisen bei Caenorhabditis elegans zu erstellen. Die vermehrten Würmer klettern auf den Deckel der Petriplatte und zeigen ein kollektives Schwarmverhalten. Das System steuert auch die Interaktionen und das Verhalten von Würmern, indem es die Luftfeuchtigkeit und die Lichtstimulation ändert. Dieses System ermöglicht es uns, die Mechanismen zu untersuchen, die kollektivem Verhalten zugrunde liegen, indem wir die Umweltbedingungen ändern und die Auswirkungen der Fortbewegung auf individueller Ebene auf kollektives Verhalten mit Hilfe von Mutanten untersuchen. Daher ist das System sowohl für die zukünftige Forschung in der Physik als auch in der Biologie nützlich.

Einleitung

Sowohl Nichtwissenschaftler als auch Wissenschaftler sind fasziniert vom kollektiven Verhalten von Tieren, wie z. B. in Vogelschwärmen und Fischschwärmen. Kollektive Verhaltensweisen wurden in einer Vielzahl von Bereichen analysiert, darunter Physik, Biologie, Mathematik und Robotik. Insbesondere die Physik der aktiven Materie ist ein wachsendes Forschungsgebiet, das sich auf Systeme konzentriert, die aus selbstfahrenden Elementen bestehen, dh dissipativen Systemen, wie Vogelschwärmen, Fischschwärmen, Biofilmen beweglicher Bakterien, Zytoskeletten, die aus aktiven Molekülen bestehen, und Gruppen von selbstfahrenden Kolloiden. Die Theorie der aktiven Materiephysik behauptet, dass, egal wie komplex das Verhalten von Individuen ist, die kollektiven Bewegungen einer enormen Anzahl von Lebewesen von einer kleinen Anzahl einfacher Regeln bestimmt werden. Zum Beispiel sagt das Vicsek-Modell, ein Kandidat für eine einheitliche Beschreibung der kollektiven Bewegung von selbstfahrenden Teilchen, voraus, dass eine Nahbereichsausrichtungsinteraktion von sich bewegenden Objekten erforderlich ist, um eine langreichweitige geordnete Phase mit exzentrischen Fluktuationen in 2D zu bilden, wie in Tierherden¹. Experimentelle Top-down-Ansätze zur Physik der aktiven Materie entwickeln sich rasant. Frühere Experimente bestätigten die Bildung einer langreichweitigen geordneten Phase in Escherichia^{coli 2}. Andere neuere Arbeiten verwendeten Zellen ^3,4, Bakterien⁵, bewegliche Kolloide⁶ oder bewegliche Proteine ^7,8. Einfache Minimalmodelle wie das Vicsek-Modell beschrieben diese realen Phänomene erfolgreich. Im Gegensatz zu diesen einzelligen Versuchssystemen werden kollektive Verhaltensweisen von Tieren in der Regel in freier Wildbahn beobachtet, da niemand hoffen konnte, kontrollierte Experimente mit 10.000 echten Vögeln oder Fischen durchzuführen.

Biologen teilen das gleiche Interesse wie Physiker: wie Individuen miteinander interagieren und sich funktional als Gruppe verhalten. Eines der traditionellen Forschungsfelder zur Analyse des individuellen Verhaltens sind die Neurowissenschaften, in denen die Mechanismen, die dem Verhalten zugrunde liegen, auf neuronaler und molekularer Ebene untersucht wurden. Bisher wurden viele neurowissenschaftliche Bottom-up-Ansätze entwickelt. Top-down-Ansätze in der Physik und Bottom-up-Ansätze in der Biologie können anhand von Modelltieren wie der Fruchtfliege, dem Wurm Caenorhabditis elegans und der Maus ermöglicht werden⁹. Es gab jedoch nur wenige Erkenntnisse über das großräumige kollektive Verhalten dieser Modelltiere im Labor¹⁰; Noch ist es schwierig, genetisch manipulierbare Modelltiere im großen Maßstab im Labor herzustellen. Daher war es in der aktuellen Forschung zu kollektivem Verhalten in Biologie und Physik für Wissenschaftler, die normalerweise im Labor forschen, schwierig, das kollektive Verhalten von Tieren zu untersuchen.

In dieser Studie haben wir eine Methode für die großflächige Kultivierung von Nematoden etabliert, um ihr kollektives Verhalten zu untersuchen. Dieses System ermöglicht es uns, Umweltbedingungen zu verändern und die Auswirkungen der Fortbewegung auf individueller Ebene auf kollektives Verhalten mit Hilfe von Mutanten^{zu untersuchen 10}. In der Physik der aktiven Materie können die Parameter des mathematischen Modells sowohl in Experimenten als auch in Simulationen gesteuert werden, was die Überprüfung dieses Modells ermöglicht, um einheitliche Beschreibungen zu identifizieren. Die Genetik wird verwendet, um den neuronalen Schaltkreismechanismus zu verstehen, der dem kollektiven Verhalten zugrunde liegt¹¹.

Protokoll

1. Vorbereitung von Würmern

HINWEIS: Bereiten Sie den Wildtyp-N2-Bristol-Stamm¹² und den ZX899-Stamm (lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP])¹³ für die Beobachtung kollektiver Verhaltensweisen bzw. optogenetischer Experimente vor. Pflegen Sie den ZX899-Stamm unter dunklen Bedingungen.

1. Legen Sie vier gut genährte erwachsene Würmer auf eine 60-mm-Platte mit 14 ml Nematodenwachstumsmedium (NGM) mit Agar und besiedelt mit E. coli OP50¹².
2. Züchten Sie F1-Würmer 7 Tage lang in der NGM-Platte bei 23 °C bis zum Verhungern. Die Ausbeute an F1-Schnecken beträgt zu diesem Zeitpunkt etwa 100 Schnecken/Platte. Die Stadien der Würmer umfassen eine gemischte Population von Dauer- und ausgehungerten L1-Larven.

2. Zubereitung von Hundefutter-Agar (DFA) Mittelplatten

1. Autoklavieren Sie eine Glasflasche mit 2 g Hundefutterpulver und 5 ml 1% Agarmedium und kühlen Sie sie auf Raumtemperatur ab (Abbildung 1A).
   HINWEIS: In diesem Experiment können andere Hundefutter verschiedener Hersteller verwendet werden.

3. Inokulation von Würmern auf DFA-Mediumplatten

1. Übertragen Sie kleine Mengen (ca. 0,5 g) DFA-Medium auf die Mitte einer NGM-Platte, die mit E. coli OP50 besiedelt ist (Abbildung 1B). Für optogenetische Experimente gießen Sie vor der Inokulation von Würmern 40 μl 50 μM all-trans-Retinal, den Cofaktor von Kanal Rhodopsin 2, auf die DFA.
2. Sammeln Sie die ausgehungerten Würmer von vier NGM-Platten mit autoklaviertem Wasser.
3. Legen Sie ein kleines Fragment des Hundefutters (ca. 0,5 g) ca. 2 mm vom Tellerdeckel entfernt auf das DFA-Medium.
4. Beleuchten Sie die NGM-Platte 15 Minuten lang mit ultraviolettem Licht in einer sauberen Bank, um eine Kontamination zu vermeiden.
5. Die gesammelten Würmer (ca. 400 Würmer) auf dem DFA-Medium auf NGM-Platten impfen. Verschließen Sie die Platte nicht mit Parafilm, um zu vermeiden, dass die Luftfeuchtigkeit in der Petriplatte erhöht wird und Wassertropfen entstehen, die Würmer auf einem Deckel einfangen.
6. Vermehren Sie die Würmer bei 23 °C und lassen Sie sie ca. 10-14 Tage bis zum Tellerdeckel klettern.
   HINWEIS: Da die Anzahl der Würmer auf den Deckeln nach 10-14 Tagen kaum zunahm, wurde vermutet, dass den Würmern wahrscheinlich das Futter ausgegangen war.

4. Beobachtung des kollektiven Verhaltens

1. Legen Sie am Tag des Experiments eine neue NGM-Platte, die kein E. coli und Hundefutter-Agar-Medium enthielt, auf eine Aluminiumplatte auf dem Tisch eines Makro-Zoom-Mikroskops (Abbildung 2A). Halten Sie den Boden dieser neuen NGM-Platte mit einem Peltier-Temperaturregler mindestens 5 Minuten lang bei 23 °C (Abbildung 2B). Ersetzen Sie dann den Deckel dieser neuen NGM-Platte durch den Deckel der Platte, auf die die Würmer geklettert sind. Verwenden Sie die Objektivlinse (x2, NA = 0,5) als Objektiv mit geringer Vergrößerung (Abbildung 2A).
2. Erhöhen Sie die Temperatur am Boden der Petriplatte von 23 °C auf 26 °C, um die Luftfeuchtigkeit in dieser Platte zu verändern (Abbildung 2).
3. Nehmen Sie Bilder der Innenfläche des Plattendeckels mit der Kamera bei 20 Bildern s⁻¹ auf (Ergänzendes Video S1).
4. Speichern Sie die erfassten Bilder im Format Tagged Image File.

5. Optogenetisches Experiment

1. Verwenden Sie eine 100-W-Quecksilberlampe, um blaues Licht zu liefern, das mit einem Filterset gefiltert wird. Steuern Sie die Beleuchtungszeit präzise mit einem elektromagnetischen Verschlusssystem (Abbildung 2B).
2. Lassen Sie den ZX899 unter diesen Bedingungen 5 Minuten lang auf DFA, bevor Sie mit blauem Licht aufleuchten.
3. Beleuchten Sie ZX899-Würmer, die am Deckel einer Petriplatte auf dem Mikroskoptisch bei 23 °C befestigt sind.
4. Nehmen Sie Bilder der Innenfläche des Plattendeckels mit einer Kamera bei 20 Bildern s⁻¹ auf (Ergänzendes Video S2).

Ergebnisse

Hier wurden Wildtyp-Dauerwürmer für kollektive Verhaltensbeobachtungen verwendet. Die Würmer wurden bei 23 °C für ca. 10-14 Tage kultiviert und kletterten bis zur Innenfläche des Deckels einer DFA-Mediumplatte. Am Versuchstag wurde nur der Deckel auf eine neue NGM-Platte ohne E. coli und DFA-Medium übertragen. Der Boden dieser Petriplatte wurde zunächst mit dem Peltier-System auf 23 °C gehalten und dann auf 26 °C erhöht. Ein Film wurde unter dem Mikroskop aufgenommen. Abbildung 3...

Diskussion

In dieser Studie zeigen wir ein Protokoll zur Vorbereitung eines Systems für das großräumige kollektive Verhalten von C. elegans im Labor. Die DFA-basierte Methode wurde ursprünglich mit Caenorhabditis japonica¹⁴ und Neoaplectana carpocapsae Weiser¹⁵ etabliert, die beide keine Modelltiere sind. Diese Methode wurde jedoch nicht angewendet, um kollektive Verhaltensweisen zu untersuchen. Der C. elegans ist ein genetisch manipulierbares M...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Escherichia coli and C. elegans strains
E. coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center	OP50	Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.
lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP]	author	ZX899	lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing ChR2 and RFP under the control of the mec-4 and unc-122 promoter, respectively
N2 Bristrol	Caenorhabditis Genetics Center		Wild-type C. elegans strain
For worm cultivation
Agar purified, powder	Nakarai tesque	01162-15	For preparation of NGM plates
All-trans retinal	Sigma-Aldrich	R2500	For optogenetics
Bacto pepton	Becton Dickinson	211677	For preparation of NGM plates
Calcium chloride	Wako	036-00485	For preparation of NGM plates
Cholesterol	Wako	034-03002	For preparation of NGM plates
di-Photassium hydrogenphosphate	Nakarai tesque	28727-95	For preparation of NGM plates
Dog food	Nihon Pet Food	VITA-ONE	For preparation of dog food agar medium
LB broth, Lennox	Nakarai tesque	20066-95	For culture of E. coli OP50
Magnesium sulfate anhydrous	TGI	M1890	For preparation of NGM plates
Petri dishes (60 mm)	Nunc	150270	For preparation of NGM plates
Potassium Dihydrogenphosphate	Nakarai tesque	28720-65	For preparation of NGM plates
Sodium Chloride	Nakarai tesque	31320-05	For preparation of NGM plates
Observation
Computer	CT solution	CS6229	Windows10 Pro with Intel Xeon Gold 6238R CPU and 768 GB of RAM
CMOS Camera	Hamamatsu photonics	ORCA-Lightning C14120-20P	For data acquisition
CMOS Camera	Olympus	DP74	For data acquisition
Microscope with SZX-MGFP set	Olympus	MVX10	For data acquisition
x2 Objective lens	Olympus	MV PLAPO 2XC	Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5
Shutter control
Shutter	OptoSigma	BSH2-RIX	For controlling temporal pattern of  light illumination
Shutter controller	OptoSigma	SSH-C2B-A	For controlling temporal pattern of  light illumination
Temperature control
Peltier temperature controller unit	VICS	WLVPU-30	For controlling humidity inside a Petri plate
UNI-THEMO CONTROLLER	Ampere	UTC-100	For controlling humidity inside a Petri plate
Data acquisition software
HCImage	Hamamatsu photonics		For data acquisition