El cultivo a gran escala de nematodos para estudiar sus comportamientos colectivos

Resumen

Aquí, se reporta un sistema para estudiar los comportamientos colectivos de los nematodos mediante su cultivo a granel utilizando medio agar alimento para perros. Este sistema permite a los investigadores propagar un gran número de gusanos dauer y se puede aplicar a Caenorhabditis elegans y otras especies relacionadas.

Resumen

Los animales exhiben comportamientos colectivos dinámicos, como se observa en bandadas de aves, bancos de peces y multitudes de humanos. Los comportamientos colectivos de los animales han sido investigados tanto en los campos de la biología como de la física. En el laboratorio, los investigadores han utilizado varios animales modelo, como la mosca de la fruta y el pez cebra, durante aproximadamente un siglo, pero sigue siendo un gran desafío estudiar el comportamiento colectivo complejo a gran escala orquestado por estos animales modelo genéticamente manejables. En este trabajo se presenta un protocolo para crear un sistema experimental de comportamientos colectivos en Caenorhabditis elegans. Los gusanos propagados trepan por la tapa de la placa de Petri y muestran un comportamiento de enjambre colectivo. El sistema también controla las interacciones y comportamientos de los gusanos cambiando la humedad y la estimulación de la luz. Este sistema nos permite examinar los mecanismos subyacentes a los comportamientos colectivos mediante el cambio de las condiciones ambientales y el examen de los efectos de la locomoción a nivel individual en los comportamientos colectivos utilizando mutantes. Por lo tanto, el sistema es útil para futuras investigaciones tanto en física como en biología.

Introducción

Tanto los no científicos como los científicos están fascinados con los comportamientos colectivos de los animales, como en las bandadas de pájaros y los bancos de peces. Los comportamientos colectivos se han analizado en una amplia gama de campos, como la física, la biología, las matemáticas y la robótica. En particular, la física de la materia activa es un campo de investigación en crecimiento que se centra en sistemas compuestos por elementos autopropulsados, es decir, sistemas disipativos, como bandadas de aves, bancos de peces, biopelículas de bacterias móviles, citoesqueletos compuestos por moléculas activas y grupos de coloides autopropulsados. La teoría de la física de la materia activa sostiene que, por muy complejos que sean los comportamientos de los individuos, los movimientos colectivos de un gran número de seres vivos se rigen por un pequeño número de reglas simples. Por ejemplo, el modelo de Vicsek, candidato para una descripción unificada del movimiento colectivo de partículas autopropulsadas, predice que se requiere una interacción de alineación de corto alcance de objetos en movimiento para formar una fase ordenada de largo alcance con fluctuación excéntrica en 2D, como en las manadas de animales¹. Los enfoques experimentales de arriba hacia abajo relacionados con la física de la materia activa se están desarrollando rápidamente. Experimentos previos confirmaron la formación de una fase ordenada de largo alcance en Escherichia^{coli 2}. Otros trabajos recientes emplearon células ^3,4, bacterias⁵, coloides móviles⁶ o proteínas en movimiento ^7,8. Modelos minimalistas simples, como el modelo de Vicsek, describieron con éxito estos fenómenos reales. A diferencia de estos sistemas experimentales unicelulares, los comportamientos colectivos de los animales suelen observarse en la naturaleza, ya que nadie podría esperar realizar experimentos controlados con 10.000 aves o peces reales.

Los biólogos comparten el mismo interés que los físicos: cómo los individuos interactúan entre sí y se comportan funcionalmente como grupo. Uno de los campos de investigación tradicionales para analizar el comportamiento individual es la neurociencia, en la que se han examinado los mecanismos subyacentes al comportamiento a nivel neuronal y molecular. Hasta ahora se han desarrollado muchos enfoques neurocientíficos de abajo hacia arriba. Los enfoques de arriba hacia abajo en física y los enfoques de abajo hacia arriba en biología pueden facilitarse utilizando animales modelo como la mosca de la fruta, el gusano Caenorhabditis elegans y el ratón⁹. Sin embargo, ha habido pocos hallazgos sobre el comportamiento colectivo a gran escala de estos animales modelo en el laboratorio¹⁰; Todavía es difícil preparar animales modelo genéticamente tratables a gran escala en el laboratorio. Por lo tanto, en la investigación actual sobre comportamientos colectivos en biología y física, ha sido difícil para los científicos que suelen investigar en el laboratorio estudiar los comportamientos colectivos de los animales.

En este estudio, establecimos un método para el cultivo a gran escala de nematodos para estudiar sus comportamientos colectivos. Este sistema nos permite cambiar las condiciones ambientales y examinar el efecto de la locomoción a nivel individual en los comportamientos colectivos utilizando mutantes¹⁰. En física de la materia activa, los parámetros del modelo matemático se pueden controlar tanto en experimentos como en simulaciones, lo que permite verificar ese modelo para identificar descripciones unificadas. La genética se utiliza para comprender el mecanismo del circuito neuronal que subyace al comportamiento colectivo¹¹.

Protocolo

1. Preparación de lombrices

NOTA: Prepare la cepa¹² y la cepa ZX899 de Bristol N2 de tipo salvaje (lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP])¹³ para la observación de comportamientos colectivos y experimentos optogenéticos, respectivamente. Mantenga la cepa ZX899 en condiciones de oscuridad.

1. Depositar cuatro gusanos adultos bien alimentados en una placa de 60 mm que contenga 14 mL de medio de crecimiento de nematodos (NGM) con agar y sembrar con E. coli OP50¹².
2. Cultive gusanos F1 hasta la inanición en la placa NGM a 23 °C durante 7 días. El rendimiento de los gusanos F1 es de aproximadamente 100 gusanos/placa en este punto. Las etapas de los gusanos comprenden una población mixta de larvas de dauer y L1 hambrientas.

2. Preparación de placas medianas de agar de comida para perros (DFA)

1. Esterilizar en autoclave un frasco de vidrio que contiene 2 g de alimento en polvo para perros y 5 ml de medio de agar al 1% y enfriarlo a temperatura ambiente (Figura 1A).
   NOTA: En este experimento se pueden utilizar otros alimentos para perros de diferentes fabricantes.

3. Inoculación de lombrices a placas de medio DFA

1. Transfiera pequeñas cantidades (aproximadamente 0,5 g) de medio DFA al centro de una placa NGM sembrada con E. coli OP50 (Figura 1B). Para experimentos optogenéticos, vierta 40 μL de 50 μM all-trans-retinal, el cofactor del canal rodopsina 2, en el DFA antes de la inoculación de los gusanos.
2. Recoja los gusanos hambrientos de cuatro placas NGM usando agua esterilizada en autoclave.
3. Coloque un pequeño fragmento de comida para perros (aproximadamente 0,5 g) en el medio DFA, a unos 2 mm de distancia de la tapa del plato.
4. Ilumine la placa NGM con luz ultravioleta durante 15 minutos dentro de un banco limpio para evitar la contaminación.
5. Inocular los gusanos recolectados (aproximadamente 400 gusanos) en el medio DFA en placas NGM. No selle la placa con parafilm para evitar aumentar la humedad dentro de la placa de Petri y generar gotas de agua que atrapen gusanos en una tapa.
6. Propagar los gusanos a 23 °C y dejar que suban hasta la tapa de la placa durante aproximadamente 10-14 días.
   NOTA: Debido a que el número de gusanos en los párpados apenas aumentó después de 10 a 14 días, se presumió que los gusanos probablemente se habían quedado sin comida.

4. Observación del comportamiento colectivo

1. El día del experimento, coloque una nueva placa NGM que no incluyera E. coli y medio de agar alimento para perros en una placa de aluminio en la platina de un microscopio con zoom macro (Figura 2A). Mantenga la parte inferior de esta nueva placa NGM a 23 °C utilizando una unidad controladora de temperatura Peltier durante al menos 5 minutos (Figura 2B). Luego, reemplace la tapa de esta nueva placa NGM con la tapa de la placa a la que treparon los gusanos. Utilice la lente del objetivo (x2, NA = 0,5) como objetivo de bajo aumento (Figura 2A).
2. Aumente la temperatura de la parte inferior de la placa de Petri de 23 °C a 26 °C para alterar la humedad dentro de esa placa (Figura 2).
3. Adquiera imágenes de la superficie interior de la tapa de la placa con la cámara a 20 fotogramas s⁻¹ (vídeo suplementario S1).
4. Guarde las imágenes adquiridas en el formato Archivo de imagen etiquetada.

5. Experimento optogenético

1. Utilice una lámpara de mercurio de 100 W para suministrar luz azul, filtrada con un juego de filtros. Controle el tiempo de iluminación con precisión mediante un sistema de obturador electromagnético (Figura 2B).
2. Mantenga el ZX899 en DFA en estas condiciones durante 5 minutos antes de la iluminación de luz azul.
3. Ilumine los gusanos ZX899 adheridos a la tapa de una placa de Petri en la platina del microscopio mantenida a 23 °C.
4. Adquiera imágenes de la superficie interior de la tapa de la placa con una cámara a 20 fotogramas s⁻¹ (vídeo complementario S2).

Resultados

Aquí, se utilizaron gusanos dauer de tipo salvaje para observaciones colectivas del comportamiento. Los gusanos se cultivaron a 23 °C durante aproximadamente 10-14 días y subieron hasta la superficie interna de la tapa de una placa mediana DFA. En el día experimental, solo la tapa se transfirió a una nueva placa NGM sin E. coli y medio DFA. La parte inferior de esta placa de Petri se mantuvo inicialmente a 23 °C utilizando el sistema Peltier, y luego se aumentó su temperatura a 26 °C. Se tomó una pelí...

Discusión

En este estudio, mostramos un protocolo para preparar un sistema para el comportamiento colectivo a gran escala de C. elegans en el laboratorio. El método basado en DFA se estableció originalmente con Caenorhabditis japonica¹⁴ y Neoaplectana carpocapsae Weiser¹⁵, ambos animales no modelo. Sin embargo, este método no se aplicó para investigar comportamientos colectivos. El C. elegans es un animal modelo genéticamente tratable

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Escherichia coli and C. elegans strains
E. coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center	OP50	Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B.
lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP]	author	ZX899	lite-1(ce314) mutant carrying the genes expressing ChR2 and RFP under the control of the mec-4 and unc-122 promoter, respectively
N2 Bristrol	Caenorhabditis Genetics Center		Wild-type C. elegans strain
For worm cultivation
Agar purified, powder	Nakarai tesque	01162-15	For preparation of NGM plates
All-trans retinal	Sigma-Aldrich	R2500	For optogenetics
Bacto pepton	Becton Dickinson	211677	For preparation of NGM plates
Calcium chloride	Wako	036-00485	For preparation of NGM plates
Cholesterol	Wako	034-03002	For preparation of NGM plates
di-Photassium hydrogenphosphate	Nakarai tesque	28727-95	For preparation of NGM plates
Dog food	Nihon Pet Food	VITA-ONE	For preparation of dog food agar medium
LB broth, Lennox	Nakarai tesque	20066-95	For culture of E. coli OP50
Magnesium sulfate anhydrous	TGI	M1890	For preparation of NGM plates
Petri dishes (60 mm)	Nunc	150270	For preparation of NGM plates
Potassium Dihydrogenphosphate	Nakarai tesque	28720-65	For preparation of NGM plates
Sodium Chloride	Nakarai tesque	31320-05	For preparation of NGM plates
Observation
Computer	CT solution	CS6229	Windows10 Pro with Intel Xeon Gold 6238R CPU and 768 GB of RAM
CMOS Camera	Hamamatsu photonics	ORCA-Lightning C14120-20P	For data acquisition
CMOS Camera	Olympus	DP74	For data acquisition
Microscope with SZX-MGFP set	Olympus	MVX10	For data acquisition
x2 Objective lens	Olympus	MV PLAPO 2XC	Working distance 20 mm and numerical aperture 0.5
Shutter control
Shutter	OptoSigma	BSH2-RIX	For controlling temporal pattern of  light illumination
Shutter controller	OptoSigma	SSH-C2B-A	For controlling temporal pattern of  light illumination
Temperature control
Peltier temperature controller unit	VICS	WLVPU-30	For controlling humidity inside a Petri plate
UNI-THEMO CONTROLLER	Ampere	UTC-100	For controlling humidity inside a Petri plate
Data acquisition software
HCImage	Hamamatsu photonics		For data acquisition